RGMa對大鼠腦缺血再灌注損傷后血管再生的影響及機(jī)制探討.pdf

1、背景與目的：缺血性腦血管疾病具有高發(fā)病率、致殘率、死亡率和復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)。卒中后的血管再生是腦梗死后早期代償?shù)闹匾^程，能改善局部血流供應(yīng)、幫助清除壞死組織，為神經(jīng)元修復(fù)、再生創(chuàng)造良好的微環(huán)境，從而促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)。排斥導(dǎo)向分子a（Repulsive guidance molecule，RGMa）是一種軸突導(dǎo)向因子，與其高親和力受體Neogenin結(jié)合后介導(dǎo)軸突生長抑制、排斥性導(dǎo)向作用，并參與神經(jīng)增殖、分化、存活等過程。近期研究發(fā)現(xiàn)，血管

2、和神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的相似性，它們之間存在一些共同的的分子信號。例如經(jīng)典的軸突導(dǎo)向因子Netrin家族，參與了血管細(xì)胞的黏附、游走、增殖、分化甚至凋亡的調(diào)控，在神經(jīng)和血管發(fā)生過程中均能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。最近有研究報(bào)道RGMa通過Neogenin下游的FAK去磷酸化抑制人臍動脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical artery endothelial cells，HUAEC）管狀結(jié)構(gòu)形成，從而抑制血管生成，但目前關(guān)于RGMa在腦缺血損傷后血

3、管系統(tǒng)中的作用尚待闡明。缺血性腦卒中后的血管再生涉及多種細(xì)胞生長因子，目前對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管生成素（Angiopoietin，Ang）家族的功能研究最為深入。VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、粘附、遷移和增加血管通透性的生物學(xué)活性，Ang2與VEGF協(xié)同作用，觸發(fā)血管的再生，Ang1則促進(jìn)結(jié)構(gòu)不完整的新生血管形成穩(wěn)定成熟的血管形態(tài)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)

4、因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）除了能促進(jìn)神經(jīng)再生，還具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞存活和再生的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用重組腺病毒rAd-shRGMa進(jìn)行特異性RNA干擾可顯著降低RGMa表達(dá)。此外， RGMa的受體Neogenin，胞外結(jié)構(gòu)含有4個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（4Ig）和6個纖維蛋白Ⅲ樣結(jié)構(gòu)域(6FNⅢ)，有文獻(xiàn)報(bào)道6FNⅢ是Neogenin上與RGMa結(jié)合的區(qū)域。因此本研究采用重組

5、腺病毒對缺血再灌注大鼠腦組織RGMa的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行RNA干擾，從而抑制RGMa表達(dá)，觀察血管再生情況，探討RNA干擾RGMa對大鼠局灶性缺血再灌注后血管再生的影響。后期研究中采用6FNⅢ對RGMa/Neogenin通路進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血皮質(zhì)VEGF、Ang1、Ang2、BDNF的表達(dá)水平，探討RGMa對大鼠腦缺血再灌注損傷后血管再生影響的潛在的機(jī)制。
　　方法：
　　1.將25只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組

6、（S）、腦缺血組（I/R）、腦缺血+重組腺病毒干預(yù)組（I/R+rAd-shRGMa）及腦缺血+空載體腺病毒注射組（I/R+rAd-HK），腦缺血組（I/R）再分為2天和7天亞組。顱內(nèi)立體定位注射腺病毒建立RNA干擾RGMa重組腺病毒轉(zhuǎn)染動物模型后，立即行大腦中動脈閉塞（MCAO）/再灌注手術(shù)。于再灌注后第2天進(jìn)行免疫熒光定位RGMa及其受體Neogenin在缺血腦組織神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)；RNA干擾RGMa后第7天進(jìn)行免疫組化法

7、標(biāo)記CD31計(jì)數(shù)缺血側(cè)皮質(zhì)微血管數(shù)，免疫熒光雙標(biāo)Ki67/CD31觀察缺血側(cè)皮質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況；所有大鼠在處死前進(jìn)行神經(jīng)功能評分。
　　2.將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（S）、腦缺血組（I/R）、腦缺血+6FNⅢ不同濃度干預(yù)組（I/R+6FNⅢ（H）：1μg/μl；I/R+6FNⅢ（M）：0.5μg/μl；I/R+6FNⅢ（L）：0.25μg/μl）及腦缺血+生理鹽水對照組（I/R+NS）六個組，分別予以等體積不同濃

8、度梯度的6FNⅢ或生理鹽水進(jìn)行側(cè)腦室注射，通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測RGMa的蛋白表達(dá)水平，探索6FNⅢ的最佳給藥濃度。然后，將90只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（S）、腦缺血組（I/R）、腦缺血+重組腺病毒干預(yù)組（I/R+rAd-shRGMa）、腦缺血+6FNⅢ組（I/R+6FNⅢ）、腦缺血+空載體重組腺病毒注射組（I/R+rAd-HK）及腦缺血+生理鹽水對照組（I/R+NS）六組，各組再分為2天、7天、14天亞組。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測再灌注后第2

9、、7、14天缺血側(cè)皮質(zhì)VEGF、Ang1、Ang2、BDNF蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.在腦缺血再灌注損傷后，RGMa及其受體Neogenin在神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞上均有表達(dá)；RNA干擾抑制RGMa表達(dá)后，微血管數(shù)量明顯增多，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯，神經(jīng)功能缺損明顯改善。
　　2.6FNⅢ能顯著降低RGMa蛋白水平，其作用與濃度呈正相關(guān)，且中濃度組與高濃度組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，選擇中濃度組6FNⅢ（0.5μg/μl）

10、作為給藥濃度；6FNⅢ干預(yù)組與 RNA干擾 RGMa腺病毒組 VEGF、Ang1、Ang2、BDNF的蛋白表達(dá)水平均較對照組明顯升高。
　　結(jié)論：
　　1.RGMa可能在缺血再灌注損傷后血管再生過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，采用重組腺病毒rAd-shRGMa進(jìn)行RNA干擾抑制RGMa表達(dá)則能促進(jìn)血管的再生，改善神經(jīng)功能障礙。
　　2.外源性6FNⅢ肽段能有效降低RGMa蛋白水平，干預(yù)RGMa/Neogenin通路；RGMa可