UQCRC1過表達(dá)在心肌保護(hù)中的作用及其信號通路研究.pdf

1、目的:
　　防治圍術(shù)期心肌缺血/再灌注損傷、為心血管疾病患者提供完善的心肌保護(hù)一直是醫(yī)學(xué)上力求攻克的難題。越來越多的研究表明,泛醇-細(xì)胞色素C還原酶核心蛋白1(Ubiquinol-cytochrome creductase core protein1,UQCRC1)表達(dá)上調(diào)可能參與了心肌保護(hù)效應(yīng),但其作用及其機(jī)制仍不清楚。本研究通過構(gòu)建UQCRC1腺病毒真核表達(dá)載體,并建立UQCRC1過表達(dá)的H9c2細(xì)胞模型,探討UQCRC1過表

2、達(dá)在心肌保護(hù)中的作用及其機(jī)制,為開發(fā)特異性的心肌保護(hù)藥物提供新的靶點(diǎn)。
　　方法:
　　通過構(gòu)建UQCRC1腺病毒真核表達(dá)載體,并在H9c2細(xì)胞過表達(dá)UQCRC1基因和蛋白,采用氧糖剝奪損傷(Oxygen-glucose deprivation,OGD)和過氧化氫損傷等方法來探討UQCRC1過表達(dá)在心肌保護(hù)中的作用,以及采用外源性Zn2+和Zn2+特異性螯合劑N,N,N',N'-四-(2-吡啶基甲基)乙二胺(N,N,N′,N

3、′-tetrakis-(2-pyridylmethyl) Ethylenediamine, TPEN)、信號通路特異性阻斷劑如磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)特異性阻斷劑 LY294002和胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular-signal-regulated kinase,ERK)特異性阻斷劑PD98059等,通過熒光探針標(biāo)記、免疫熒光染色以及Western blot等技

4、術(shù),檢測細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位、線粒體內(nèi)游離鋅離子濃度及相關(guān)信號蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),以研究UQCRC1過表達(dá)在心肌保護(hù)中作用及其相關(guān)的信號通路。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建UQCRC1腺病毒真核表達(dá)載體,并在H9c2心肌細(xì)胞成功建立UQCRC1過表達(dá)模型。
　　2、UQCRC1過表達(dá)在H9c2心肌細(xì)胞OGD損傷和過氧化損傷中起保護(hù)作用。OGD損傷后,UQCRC1過表達(dá)能上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)

5、和下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)、減少Active Caspase3的表達(dá)、增加心肌細(xì)胞存活率;UQCRC1過表達(dá)還能降低過氧化損傷后心肌細(xì)胞凋亡率、維持細(xì)胞線粒體的膜電位。
　　3、UQCRC1通過與Zn2+結(jié)合產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng),外源性 Zn2+能增強(qiáng)UQCRC1的心肌保護(hù)作用,螯合掉細(xì)胞內(nèi)Zn2+則完全消除UQCRC1過表達(dá)的保護(hù)作用;UQCRC1表達(dá)上調(diào)能使細(xì)胞線粒體內(nèi)游離Zn2+濃度降低,而下調(diào)UQCRC1表達(dá)則能釋放較多的Zn2

6、+使線粒體內(nèi)游離 Zn2+濃度顯著增高。結(jié)果提示,Zn2+是 UQCRC1發(fā)揮心肌保護(hù)作用的必不可少的輔因子,而UQCRC1則可能是Zn2+在線粒體內(nèi)的重要結(jié)合位點(diǎn)。
　　4、UQCRC1通過激活PI3K/Akt/GSK-3β信號通路上調(diào)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)和抑制OGD損傷后Caspase3凋亡信號通路的激活以及增加心肌細(xì)胞的存活率、維持線粒體膜電位和減少細(xì)胞凋亡,從而產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)。
　　(1)抑制PI3K活性

7、能完全消除UQCRC1過表達(dá)對OGD損傷或過氧化損傷后心肌細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位的保護(hù)作用。
　　(2)UQCRC1過表達(dá)能增加OGD損傷后H9c2心肌細(xì)胞PI3K下游信號分子蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB即Akt)的磷酸化水平而激活A(yù)kt、增加糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的磷酸化水平而使GSK-3β活性降低;抑制PI3K活性則完全消除O

8、GD損傷后UQCRC1過表達(dá)對PI3K下游信號分子Akt和GSK-3β的磷酸化。
　　(3)UQCRC1過表達(dá)可調(diào)節(jié)H9c2心肌細(xì)胞OGD損傷后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而減少細(xì)胞凋亡損傷。UQCRC1過表達(dá)能減少OGD損傷后Active Caspase3的表達(dá),從而抑制心肌細(xì)胞Caspase3凋亡信號通路的激活;UQCRC1過表達(dá)還可增加OGD損傷后Bcl-2蛋白的表達(dá),減少Bax蛋白的表達(dá),使Bax/Bcl-2的比值降低,從而增加心肌

9、細(xì)胞的抗凋亡損傷作用;抑制PI3K活性則能完全消除UQCRC1過表達(dá)對OGD損傷后Active Caspase3的影響,同時(shí)也完全消除了對Bax和Bcl-2表達(dá)的影響。
　　5、UQCRC1部分通過激活ERK/GSK-3β信號通路來產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)。
　　(1)抑制ERK活性后,部分消除OGD損傷和過氧化損傷后UQCRC1過表達(dá)對心肌細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位的保護(hù)作用。
　　(2)抑制ERK活性能部分消除UQC

10、RC1過表達(dá)對GSK-3β的磷酸化作用。
　　(3)抑制ERK活性能部分消除UQCRC1過表達(dá)減少OGD損傷后Active Caspase3表達(dá)的作用,同時(shí)也部分消除了對Bax的下調(diào)表達(dá)和對Bcl-2的上調(diào)表達(dá)作用。
　　結(jié)論:
　　1、UQCRC1過表達(dá)在H9c2心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷和過氧化損傷中起保護(hù)作用。
　　2、Zn2+是UQCRC1過表達(dá)產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)的必不可少的輔助因子,同時(shí), UQCRC1也是