低氧誘導(dǎo)因子-1a在心肌缺血預(yù)處理與后處理心肌保護(hù)中的作用.pdf

1、本文研究目的： 1．觀察在心肌缺血/再灌注時(shí)給予缺血預(yù)處理及后處理后低氧誘導(dǎo)因子-1α的蛋白表達(dá)情況： 2．探討低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)變化與缺血預(yù)處理及后處理的心肌保護(hù)效應(yīng)的關(guān)系。 研究方法： 選取健康雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為4組： ①偽手術(shù)組(sham，n=10)．僅在左冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending artery，LAD)下穿線(xiàn)，不結(jié)扎，持續(xù)22

2、5min； ②缺血/再灌注組(I/R，n=10)：可逆性結(jié)扎LAD造成心肌缺血45min，再灌注3h： ③缺血預(yù)處理組(IP，n=10)：給予3個(gè)循環(huán)的5 min缺血/5 min再灌注作為缺血預(yù)處理，隨后給予可逆性結(jié)扎LAD造成心肌缺血45min，再灌注3h； ④缺氧后處理組(PC，n=10)：可逆性結(jié)扎LAD造成心肌缺血45min，隨即進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的再灌注10s/缺血10s的缺血后適應(yīng)，再行再灌注3h。

3、 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用Even's blue和TTC雙染，測(cè)定心肌危險(xiǎn)區(qū)與梗塞區(qū)面積：利用免疫組織化學(xué)技術(shù)、Western蛋白免疫印跡檢測(cè)心肌HIF-1α的表達(dá)；用DNA原位末端缺口標(biāo)記法并配合caspase-3的活性檢測(cè)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)；制備血清，檢測(cè)CK活性和MDA含量。 研究結(jié)果： 1.缺血/再灌注模型的建立。 1.1心肌缺血/再灌注損傷對(duì)心肌梗塞面積的影響危險(xiǎn)區(qū)面積占左心室面積的百分比(AAR/LV比值)：

4、在偽手術(shù)組與缺血/再灌注組之間無(wú)顯著性差異，各組動(dòng)物模型的缺血程度大體一致，具有可比性。 心肌梗塞面積占危險(xiǎn)區(qū)面積百分比(AN/AAR比值)：缺血/再灌注(I/R)組與偽手術(shù)(sham)組相比明顯增高(44.17％±3.24％vs.3.36％±0.87％，P<0.01)(表1，圖2，圖3)。 1.2心肌缺血/再灌注損傷對(duì)血清肌酸激酶(CK)活性的影響實(shí)驗(yàn)采用CK活性作為評(píng)價(jià)心肌損傷的指標(biāo)。經(jīng)CK試劑盒檢測(cè)可見(jiàn)，缺血/再灌

5、注(I/R)組與sham組相比，血清CK活性明顯增高(10.17±2.36 U/ml vs.0.037±0.01U/ml，P<0.01)，(表1，圖4)。 1.3心肌缺血/再灌注損傷對(duì)血清丙二醛(MDA)含量的影響MDA含量可反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，同時(shí)間接地反應(yīng)出細(xì)胞損傷的程度。結(jié)果顯示：缺血/再灌注(I/R)組血清MDA含量明顯高于sham組(0.27±0.03 nmol/ml vs.0.04±0.01 nmol/ml，

6、P<0.01)(表1，圖5)。 1.4.心肌缺血/再灌注損傷對(duì)細(xì)胞凋亡的影響DNA原位末端缺口標(biāo)記法(TUNEL)心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：偽手術(shù)組(sham)大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)為(1.45±0.41)％，缺血/再灌注組(I/R)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高達(dá)到(17.68±2.44)％，I/R與sham兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(圖6，圖7)。 由于TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡具有敏感性高、但特異性較差的特點(diǎn)，

7、因此我們配合檢測(cè)了缺血/再灌注心肌組織的caspase-3比活性來(lái)共同說(shuō)明心肌細(xì)胞的凋亡情況。caspase-3檢測(cè)結(jié)果顯示：與sham組(1.00±0.14)相比，缺血/再灌注組caspase-3比活性明顯增高，達(dá)到2.22±0.39(P<0.01)(圖8)。 以上結(jié)果均證明心肌缺血/再灌注模型建立成功。 2.缺血預(yù)處理和缺血后處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。 2.1缺血預(yù)處理和缺血后處理對(duì)心肌梗塞面積的

8、影響危險(xiǎn)區(qū)面積占左心室面積的百分比(AAR/LV比值)：在缺血/再灌注組、缺血預(yù)處理組和缺血后處理之間無(wú)顯著性差異，各組動(dòng)物模型的缺血程度大體一致，具有可比性(見(jiàn)表2，圖2，圖9a)。 心肌梗塞面積占危險(xiǎn)區(qū)面積百分比(AN/AAR比值)：缺血預(yù)處理組(IP)的AN/AAR比值為(23.76±7.78)％，與缺血/再灌注組(44.17％±3.24％)相比明顯降低(P<0.01)；缺血后處理(PC)的AN/AAR比值為(19.79±

9、2.42)％，與I/R組相比也明顯降低(P<0.01)；而IP與PC相比，則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2，圖2，圖9b)。 2.2缺血預(yù)處理和缺血后處理對(duì)血清肌酸激酶(CK)活性的影響缺血/再灌注組(I/R)血清肌酸激酶活性為10.17±2.36U/ml，缺血預(yù)處理組(IP)血清肌酸激酶活性為7.84±0.87U/ml，與IfR組相比明顯降低(P<0.05)：缺血后處理(PC)組血清肌酸激酶活性(7.67±1.15U/ml)與I/R組相比

10、也明顯降低(P<0.05)；而IP組與PC組相比，則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3，圖10)。 2.3缺血預(yù)處理和缺血后處理對(duì)血清丙二醛(MDA)含量的影響血清MDA含量在缺血預(yù)處理組(IP)組為0.16±0.02 nmol/ml，缺血后處理組(PC)為0.16±0.02 nmol/ml。IP、PC組與缺血/再灌注組(0.27±0.03 nmol/ml)相比，均顯著降低(P<0.01)；而IP組與PC組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(表3，圖11)。

11、 2.4缺血預(yù)處理和缺血后處理對(duì)細(xì)胞凋亡的影響DNA原位末端缺口標(biāo)記法(TUNEL)心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)：缺血/再灌注組(I/R)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(17.68±2.44)％，預(yù)處理組(IP)及后處理組(PC)與UR組相比心肌細(xì)胞的凋亡均顯著減少，其細(xì)胞凋亡指數(shù)分別降至(13.79±1.29)％和(11.34±1.54)％，P值均小于0.01(表4，圖12，圖13a)。IP組與PC組相比，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 caspase-3比

12、活性分析：caspase-3比活性在IP組為1.53±0.25，PC組為1.23±0.26，與I/R組(2.22±0.39)相比均顯著降低(P<0.01)(表4，圖13b)。IP組與PC組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。檢測(cè)結(jié)果提示，預(yù)處理及后處理均可抑制缺血/再灌注后心肌細(xì)胞的凋亡。其檢測(cè)結(jié)果與TUNEL法基本一致。 3.心肌組織HIF-1α蛋白表達(dá)量檢測(cè)。 3.1心肌組織HIF-1α蛋白表達(dá)量的免疫組織化學(xué)檢測(cè)偽手術(shù)(sham)組

13、大鼠心肌組織僅有少量HIF-1α蛋白表達(dá)，缺血/再灌注組(I/R)與sham組相比，其HIF-1α免疫組化染色積分光密度(IOD)顯著增強(qiáng)(8331.64±527.40vs.2263.54±523.32，P<0.01)。缺血預(yù)處理組(IP)和缺血后處理組(PC)與I/R組相比，它們的HIF-1α IOD均值明顯增強(qiáng)，分別為9394.61±757.31和9847.20±940.66，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和P<0.01)(圖14，圖

14、15)。免疫組化染色結(jié)果可見(jiàn)HIF-1α在細(xì)胞核與細(xì)胞漿內(nèi)均有表達(dá)。 3.2心肌組織HIF-1α蛋白表達(dá)量Western-blot測(cè)定缺血/再灌注組(I/R)與sham組相比能明顯誘導(dǎo)HIF-1 α蛋白的表達(dá)(1.70±0.34 vs.1.0±0.20，P<0.01)，而缺血預(yù)處理(TP)和缺血后處理(PC)均可顯著增加I/R后心肌細(xì)胞的HIF-1α蛋白表達(dá)量，分別為(2.13±0.39)和(2.07±0.33)，P值均小于0.

15、05(圖16，圖17)。 4.HIF-1α蛋白表達(dá)量與反映心肌損傷各指標(biāo)(心肌梗塞面積、CK活性、MDA含量及caspase-3比活性)之間的相關(guān)性分析采用SPSS 11.0軟件對(duì)各組心肌梗塞面積、CK活性、MDA含量及caspase-3比活性分別與HIF-1α表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明：心肌梗塞面積與HIF-1α蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為r=-0.842，P<0.01(見(jiàn)圖18)；CK活性與HIF-1α蛋白表達(dá)量呈負(fù)相

16、關(guān)，r=-0.796，P<0.01(見(jiàn)圖19)；MDA含量與HIF-1α蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，r=-0.839(見(jiàn)圖20)：caspase-3比活性與。HIF-1 α蛋白表達(dá)量也呈負(fù)相關(guān)，r=-0.84，P<0.01(見(jiàn)圖21)。 研究結(jié)論： (1).缺血預(yù)處理和后處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷均具有保護(hù)作用，能明顯降低心梗面積、CK活性和MDA含量，并減少心肌細(xì)胞的凋亡。 (2).大鼠心肌在缺血/再灌注后，HIF-1

17、α的蛋白表達(dá)量明顯增加，提示該因子是心肌細(xì)胞缺血時(shí)的重要分子反應(yīng)。 (3).心肌缺血預(yù)處理和后處理能使心肌缺血/再灌注后的HIF-1α蛋白表達(dá)量進(jìn)一步明顯增加，提示缺血預(yù)處理和后處理均有誘導(dǎo)心肌組織HIF-1α表達(dá)的效應(yīng)。 (4).缺血預(yù)處理及后處理所引起的HIF-1α蛋白表達(dá)量的增加與反映心肌損傷各指標(biāo)之間均有很高的負(fù)相關(guān)性，提示HIF-1α與缺血預(yù)處理以及后處理的心肌保護(hù)作用有密切關(guān)系。 (5)．缺血預(yù)處理與