UQCRC1在二氮嗪延遲預(yù)處理心肌保護中的作用及其機制研究.pdf

1、目的:
　　近年來,隨著人口老齡化和我國醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,老年患者、心臟疾病行非心臟手術(shù)患者以及心臟手術(shù)患者逐年增多,圍手術(shù)期心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)損傷的風險也相應(yīng)增加。心肌缺血/再灌注損傷是圍手術(shù)期患者并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率增加的重要原因[1]。因此,為圍手術(shù)期患者提供有效的心肌保護仍是臨床醫(yī)生必須解決的難題。缺血預(yù)處理(Ischemia Preconditioning,IPC)是通過觸

2、發(fā)機體內(nèi)源性抗損傷機制而增強心肌細胞對缺血缺氧的耐受能力。IPC的保護作用呈雙相過程,第一相稱為預(yù)處理的快速相,出現(xiàn)在預(yù)處理的數(shù)分鐘,持續(xù)1-3h。第二相稱為預(yù)處理的延遲相(Second Window of Protection,SWOP),出現(xiàn)在初次缺血后的12-72h。研究結(jié)果表明,IPC時心肌保護效果最強的時間位點是在延遲相[2][3][4]。圍手術(shù)期麻醉藥物,如嗎啡等阿片類藥、七氟醚和異氟醚等吸入性麻醉藥等都能通過SWOP產(chǎn)生心

3、肌保護作用[5][6][7]。然而,由于SWOP的作用機制尚未完全闡明,從而限制了SWOP在臨床上的廣泛應(yīng)用。
　　有蛋白質(zhì)組學研究表明,SWOP可使心肌線粒體呼吸鏈中的多個蛋白表達上調(diào)[8],這提示線粒體呼吸鏈的蛋白表達上調(diào)可能在SWOP中具有重要意義。泛醇-細胞色素c還原酶核心蛋白1(Ubiquinol-cytochrome c reductase core protein1,UQCRC1)是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ上的一個亞單位

4、,具有重要的生理功能。我們前期的蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn),UQCRC1的表達改變與大鼠心肌的SWOP呈正相關(guān)。由此,我們推測UQCRC1可能在SWOP中起了重要作用,它可能是又一新發(fā)現(xiàn)的保護性蛋白。
　　近年來的研究結(jié)果表明,線粒體KATP通道是IPC和藥物預(yù)處理如嗎啡、舒芬太尼、七氟醚、異氟醚等延遲預(yù)處理的共同“終末效應(yīng)器”[1][2][3][4],開放線粒體 KATP通道是它們產(chǎn)生心肌保護作用的共同信號通路。二氮嗪(Diazoxid

5、e, DZ)是線粒體KATP通道的特異性開放劑。因此,本研究選用二氮嗪的SWOP來研究UQCRC1在延遲預(yù)處理心肌保護中的作用及機制,具有很好的代表性。
　　本研究采用腺病毒載體與RNA干擾技術(shù),通過大鼠H9C2心肌細胞UQCRC1基因的過表達和表達沉默,并且建立氧糖剝奪(Oxygen glucose deprivation,OGD)模型模擬缺血/再灌注損傷,研究UQCRC1在二氮嗪延遲預(yù)處理H9C2心肌細胞抗缺血/再灌注損傷中的

6、保護作用及其機制,為研發(fā)以UQCRC1作為分子靶點的心肌保護藥物和闡明SWOP心肌保護的機制提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、本實驗合成三種不同的siUQCRC1序列,采用RT-PCR和Western Blot等方法檢測不同序列和不同濃度的siUQCRC1對UQCRC1基因和蛋白表達的影響,從中篩選出最有效的siUQCRC1序列和最佳有效濃度。
　　2、構(gòu)建UQCRC1腺病毒載體,采用Western Blot法檢測U

7、QCRC1過表達、二氮嗪即時和延遲預(yù)處理后H9C2心肌細胞UQCRC1蛋白的表達,以及采用線粒體KATP通道特異性阻滯劑5-羥葵酸(5-hydroxydecanote,5-HD)進行干擾實驗,觀察SWOP后UQCRC1的表達水平及其與線粒體KATP通道開放的關(guān)系。
　　3、采用CCK-8法檢測細胞存活率、Hoechst33342熒光標記凋亡細胞、四甲基羅丹明乙酯(tetramethyrhodamine ester,TMRE)熒光染

8、色標記線粒體膜電位等方法,觀察SWOP對OGD損傷后H9C2心肌細胞存活率、細胞凋亡率和線粒體膜電位的影響及其與UQCRC1表達的關(guān)系。
　　4、采用Western Blot法檢測H9C2心肌細胞Bcl-2、Bax及Cox-2蛋白表達,OGD損傷后active caspase-3的表達以及pho-Akt(Ser473)、Akt、pho-GSK3β(S9)、GSK3β蛋白的表達,觀察SWOP和UQCRC1表達對心肌細胞保護性蛋白Bc

9、l-2、Cox-2等表達、OGD損傷后caspase-3細胞凋亡信號和Akt/GSK-3β細胞保護信號激活的影響。
　　結(jié)果:
　　1、靶序列為CCGUUGCUGUAGCUAACAAdTdT的siUQCRC1序列對UQCRC1 mRNA的抑制作用最顯著,該序列在轉(zhuǎn)染濃度為200nmol/L時對UQCRC1蛋白的表達抑制作用最佳。
　　2、二氮嗪延遲預(yù)處理能顯著上調(diào)UQCRC1蛋白的表達,其表達上調(diào)是通過開放線粒體KAT

10、P通道來實現(xiàn)的;采用5-HD使二氮嗪預(yù)處理時線粒體KATP通道關(guān)閉,則能完全消除二氮嗪延遲預(yù)處理后UQCRC1的表達上調(diào),同時其心肌保護作用也隨之消失。
　　3、SWOP是通過上調(diào)表達UQCRC1而產(chǎn)生心肌保護作用的。UQCRC1表達上調(diào)能顯著增加OGD損傷后心肌細胞的存活率、減少細胞凋亡和保持線粒體膜電位;而抑制SWOP后的UQCRC1表達上調(diào),則能完全消除SWOP對心肌細胞的保護作用。
　　4、SWOP通過上調(diào)H9C2心

11、肌細胞UQCRC1的表達,繼而使細胞保護性蛋白Bcl-2和Cox-2等表達增加、Bcl-2/Bax比率增高,從而產(chǎn)生保護效應(yīng);而下調(diào)UQCRC1表達能消除SWOP對心肌細胞Bcl-2和Cox-2蛋白表達的影響。
　　5、SWOP后心肌細胞UQCRC1的表達上調(diào)能顯著抑制OGD損傷后active caspase-3蛋白的表達、增加磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白表達;下調(diào)UQCRC1的表達則能完全消除SWOP對active casp

12、ase-3、磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白表達的影響,同時也消除了OGD損傷后的心肌細胞保護。
　　結(jié)論:
　　1、轉(zhuǎn)染濃度為200nmol/L、靶序列為CCGUUGCUGUAGCUAACAAdTdT的siUQCRC1序列,能有效抑制H9C2心肌細胞UQCRC1的表達。
　　2、二氮嗪延遲預(yù)處理通過開放線粒體KATP通道而上調(diào)UQCRC1蛋白表達,從而對心肌細胞缺血/再灌注損傷起到保護作用。
　　3、上調(diào)Bcl