Exendin-4-HSA長效融合蛋白的構建表達與活性研究.pdf

1、糖尿病是多因素所致的內分泌紊亂性疾病，主要有1型（胰島素依賴型）和2型（非胰島素依賴型）糖尿病。據(jù)預測，到2025年全球糖尿病患者人數(shù)將達3億，其中90％為2型糖尿病。2型糖尿病的傳統(tǒng)治療藥物主要有二甲雙胍、磺脲類藥物等，這些藥物的長期使用會導致胰島細胞功能衰竭，不能有效控制病情發(fā)展。
　　胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like polypeptidel，GLP-1）是由腸道L細胞分泌的一種肽類激素，能夠刺激胰島素的分泌、

2、增加胰島素的生物合成，通過調節(jié)胰島素和胰高血糖素的分泌而影響葡萄糖代謝，對糖尿病有很好的治療效果。
　　促胰島素分泌肽(Exendin-4，E4)是從生長在美國西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中發(fā)現(xiàn)的一個激素物質，由39個氨基酸組成，與GLP-1相似性高達53％，并且生物學效應也幾乎完全一致。它能增加胞內cAMP濃度，刺激葡萄糖依賴的胰島素分泌，抑制β細胞凋亡，刺激β細胞的增殖與新生，還具有降低饑餓及餐后血糖濃度和胰高血糖素濃度等

3、生物學效應;E4的半衰期為2-3 h，遠長于GLP-1的1-2 min，穩(wěn)定性和生物活性也明顯高于GLP-1，具有更好的治療效果。但作為糖尿病的治療藥物其半衰期仍較短，且天然產(chǎn)物含量較少，而化學合成的方法存在成本高、步驟多、收率低、合成過程涉及有害化學物質等缺點，尚無法滿足大規(guī)模的臨床需求。相關的研究表明通過基因工程方法構建長效融合蛋白既能夠延長Exendin-4的半衰期，又可大大降低生產(chǎn)成本。
　　本實驗的研究目的主要是利用合成

4、生物學中的BglBrick方法將優(yōu)化后的Exendin-4基因與HSA基因進行不同方式的融合表達，通過體外活性檢測篩選候選長效融合蛋白。使所獲的長效融合蛋白能夠在高效發(fā)揮生物學功能的前提下，延長在血漿中的半衰期，最終提高治療效果。主要研究內容及結果包括:
　　1.以pHI_D2_HSA/IFN質粒為模板，通過PCR擴增（在擴增引物的上下游分別添加XhoⅠ、BglⅡ和NotⅠ、BamHⅠ酶切位點）獲得引入相應酶切位點的HSA基因片段

5、，連入表達載體質粒pPICZαA上，構建出pPICZαA-HSA表達載體。
　　2.通過NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到編碼Exendin-4開放閱讀框序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛性進行優(yōu)化后，在片段的兩端分別添加XhoⅠ、BglⅡ和BamHⅠ、NotⅠ酶切位點，人工合成，連入表達載體質粒pPICZαA上，構建出pPICZαA-E4表達載體。
　　3.利用合成生物學中的BglBrick方法以pPICZαA-HSA和pPICZαA-E

6、4兩表達載體作為基礎表達載體構建出十種不同形式的Exendin-4/HSA融合蛋白表達載體，將線性化后的表達載體用電轉化方法轉化入畢赤酵母KM71H基因組中，用甲醇誘導表達，所獲菌液上清經(jīng)過SDS-PAGE分析，都分別獲得相應的目的蛋白。
　　4.對于誘導表達的目的蛋白分別經(jīng)疏水層析、陰離子層析或親和層析進行分離純化，最終獲得了純度達90％以上的其中八種目的蛋白。
　　5.以GLP-1蛋白作為陽性藥物，用MTT方法檢測對RI

7、N-m-5F、MIN6細胞增殖的影響、用ELISA方法檢測對INS-1、MIN6細胞胰島素分泌量的影響、用ELISA方法檢測對BHK-GLP-1R細胞cAMP分泌水平的影響，通過對上述方法的綜合比較，建立了用ELISA方法檢測目的蛋白對MIN6細胞胰島素分泌量的體外生物活性活性測定方法，該方法效果最好、步驟簡單、重復性好，適用于融合蛋白的體外生物活性檢測。
　　6.使用胰島素檢測方法評價所獲的八種長效融合蛋白體外生物活性。將終濃度

8、為250μg/mL的八種目的蛋白，作用處于對數(shù)期的MIN6細胞，2h后，用胰島素試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中胰島素分泌量的變化，實驗結果表明八種長效融合蛋白對MIN6細胞的胰島素分泌都有一定的刺激作用，其中(E4)4-HSA、E4-HSA-E4兩種融合蛋白的作用效果最好，胰島素的分泌量提高了41.06％、42.89％。
　　本實驗利用合成生物學中的BglBrick方法構建長效融合蛋白表達載體實現(xiàn)了Exendin-4/HSA長效融合蛋白的

9、快速組裝，BglBrick方法實現(xiàn)了能夠隨意的在不同基因的任意末端連接任意個數(shù)的其他基因。長效融合蛋白表達載體電轉化入畢赤酵母菌KM71H后，經(jīng)過甲醇的誘導，十種表達載體均表達出相應的融合蛋白，為長效融合蛋白的快速構建提供了新的思路。將誘導后的菌液進行分步分離純化后都獲得了高純度的長效融合蛋白，方便后續(xù)體外生物活性的測定。篩選建立的胰島素檢測方法實驗效果明顯，重復性好，適用于融合蛋白體外生物活性的評價。體外生物活性的評價結果為后續(xù)融合蛋