Exendin-4-HSA長(zhǎng)效融合蛋白的構(gòu)建表達(dá)與活性研究.pdf

1、糖尿病是多因素所致的內(nèi)分泌紊亂性疾病，主要有1型（胰島素依賴型）和2型（非胰島素依賴型）糖尿病。據(jù)預(yù)測(cè)，到2025年全球糖尿病患者人數(shù)將達(dá)3億，其中90％為2型糖尿病。2型糖尿病的傳統(tǒng)治療藥物主要有二甲雙胍、磺脲類藥物等，這些藥物的長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致胰島細(xì)胞功能衰竭，不能有效控制病情發(fā)展。
　　胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like polypeptidel，GLP-1）是由腸道L細(xì)胞分泌的一種肽類激素，能夠刺激胰島素的分泌、

2、增加胰島素的生物合成，通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素和胰高血糖素的分泌而影響葡萄糖代謝，對(duì)糖尿病有很好的治療效果。
　　促胰島素分泌肽(Exendin-4，E4)是從生長(zhǎng)在美國(guó)西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)激素物質(zhì)，由39個(gè)氨基酸組成，與GLP-1相似性高達(dá)53％，并且生物學(xué)效應(yīng)也幾乎完全一致。它能增加胞內(nèi)cAMP濃度，刺激葡萄糖依賴的胰島素分泌，抑制β細(xì)胞凋亡，刺激β細(xì)胞的增殖與新生，還具有降低饑餓及餐后血糖濃度和胰高血糖素濃度等

3、生物學(xué)效應(yīng);E4的半衰期為2-3 h，遠(yuǎn)長(zhǎng)于GLP-1的1-2 min，穩(wěn)定性和生物活性也明顯高于GLP-1，具有更好的治療效果。但作為糖尿病的治療藥物其半衰期仍較短，且天然產(chǎn)物含量較少，而化學(xué)合成的方法存在成本高、步驟多、收率低、合成過(guò)程涉及有害化學(xué)物質(zhì)等缺點(diǎn)，尚無(wú)法滿足大規(guī)模的臨床需求。相關(guān)的研究表明通過(guò)基因工程方法構(gòu)建長(zhǎng)效融合蛋白既能夠延長(zhǎng)Exendin-4的半衰期，又可大大降低生產(chǎn)成本。
　　本實(shí)驗(yàn)的研究目的主要是利用合成

4、生物學(xué)中的BglBrick方法將優(yōu)化后的Exendin-4基因與HSA基因進(jìn)行不同方式的融合表達(dá)，通過(guò)體外活性檢測(cè)篩選候選長(zhǎng)效融合蛋白。使所獲的長(zhǎng)效融合蛋白能夠在高效發(fā)揮生物學(xué)功能的前提下，延長(zhǎng)在血漿中的半衰期，最終提高治療效果。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果包括:
　　1.以pHI_D2_HSA/IFN質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增（在擴(kuò)增引物的上下游分別添加X(jué)hoⅠ、BglⅡ和NotⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)）獲得引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)的HSA基因片段

5、，連入表達(dá)載體質(zhì)粒pPICZαA上，構(gòu)建出pPICZαA-HSA表達(dá)載體。
　　2.通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到編碼Exendin-4開(kāi)放閱讀框序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛(ài)性進(jìn)行優(yōu)化后，在片段的兩端分別添加X(jué)hoⅠ、BglⅡ和BamHⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)，人工合成，連入表達(dá)載體質(zhì)粒pPICZαA上，構(gòu)建出pPICZαA-E4表達(dá)載體。
　　3.利用合成生物學(xué)中的BglBrick方法以pPICZαA-HSA和pPICZαA-E

6、4兩表達(dá)載體作為基礎(chǔ)表達(dá)載體構(gòu)建出十種不同形式的Exendin-4/HSA融合蛋白表達(dá)載體，將線性化后的表達(dá)載體用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母KM71H基因組中，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，所獲菌液上清經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析，都分別獲得相應(yīng)的目的蛋白。
　　4.對(duì)于誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白分別經(jīng)疏水層析、陰離子層析或親和層析進(jìn)行分離純化，最終獲得了純度達(dá)90％以上的其中八種目的蛋白。
　　5.以GLP-1蛋白作為陽(yáng)性藥物，用MTT方法檢測(cè)對(duì)RI

7、N-m-5F、MIN6細(xì)胞增殖的影響、用ELISA方法檢測(cè)對(duì)INS-1、MIN6細(xì)胞胰島素分泌量的影響、用ELISA方法檢測(cè)對(duì)BHK-GLP-1R細(xì)胞cAMP分泌水平的影響，通過(guò)對(duì)上述方法的綜合比較，建立了用ELISA方法檢測(cè)目的蛋白對(duì)MIN6細(xì)胞胰島素分泌量的體外生物活性活性測(cè)定方法，該方法效果最好、步驟簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，適用于融合蛋白的體外生物活性檢測(cè)。
　　6.使用胰島素檢測(cè)方法評(píng)價(jià)所獲的八種長(zhǎng)效融合蛋白體外生物活性。將終濃度

8、為250μg/mL的八種目的蛋白，作用處于對(duì)數(shù)期的MIN6細(xì)胞，2h后，用胰島素試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中胰島素分泌量的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明八種長(zhǎng)效融合蛋白對(duì)MIN6細(xì)胞的胰島素分泌都有一定的刺激作用，其中(E4)4-HSA、E4-HSA-E4兩種融合蛋白的作用效果最好，胰島素的分泌量提高了41.06％、42.89％。
　　本實(shí)驗(yàn)利用合成生物學(xué)中的BglBrick方法構(gòu)建長(zhǎng)效融合蛋白表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了Exendin-4/HSA長(zhǎng)效融合蛋白的

9、快速組裝，BglBrick方法實(shí)現(xiàn)了能夠隨意的在不同基因的任意末端連接任意個(gè)數(shù)的其他基因。長(zhǎng)效融合蛋白表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母菌KM71H后，經(jīng)過(guò)甲醇的誘導(dǎo)，十種表達(dá)載體均表達(dá)出相應(yīng)的融合蛋白，為長(zhǎng)效融合蛋白的快速構(gòu)建提供了新的思路。將誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行分步分離純化后都獲得了高純度的長(zhǎng)效融合蛋白，方便后續(xù)體外生物活性的測(cè)定。篩選建立的胰島素檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)效果明顯，重復(fù)性好，適用于融合蛋白體外生物活性的評(píng)價(jià)。體外生物活性的評(píng)價(jià)結(jié)果為后續(xù)融合蛋