IL2-HSA融合蛋白ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一種由激活的T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，通過(guò)促進(jìn)輔助性T淋巴細(xì)胞以及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)人體的免疫能力，現(xiàn)已經(jīng)成為臨床治療腫瘤和自身免疫性疾病的一種引人注目的生物制劑。為提高IL-2在體內(nèi)的半衰期，實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了攜帶有IL2-HSA融合蛋白編碼基因的質(zhì)粒pPIH，并在Pichiapastoris GS115中成功表達(dá)。該方法增大了蛋白藥物的分子量，降低了異源蛋白的免疫原性，從而可

2、以減少腎小球?yàn)V過(guò)率和體內(nèi)清除率，有效提高IL-2在體內(nèi)的半衰期，具有非常廣闊的生產(chǎn)以及臨床應(yīng)用前景。在即將進(jìn)行的藥代動(dòng)力學(xué)研究和后期臨床應(yīng)用中迫切需要一種能夠定量檢測(cè)IL2-HSA融合蛋白的方法。本課題旨在建立一種雙抗體夾心ELISA方法，可以定量檢測(cè)完整的IL2-HSA融合蛋白。
　　 首先從已經(jīng)構(gòu)建好的IL2-HSA表達(dá)菌株P(guān)ichiapastoris GS115出發(fā)，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、蛋白純化得到純度較高的IL2-HSA融合蛋白

3、，作為抗原標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)過(guò)蛋白定量分析，抗原標(biāo)準(zhǔn)品含量為80μg/mL；WestenBlot分析表明，該融合蛋白同時(shí)具有IL-2和HSA的免疫原性；利用IL-2依賴細(xì)胞株CTLL-2，采用MTT法測(cè)定融合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的比活性為1.393×107IU/mg。然后選取兩株針對(duì)IL2-HSA融合蛋白兩端多肽的抗體，建立了雙抗體夾心ELISA定量檢測(cè)IL2-HSA融合蛋白原型藥物的方法。該檢測(cè)方法的靈敏度達(dá)到10.25ng/mL，線性檢測(cè)范圍19.5

4、3ng/mL～1250ng/mL，相關(guān)系數(shù)r2>0.988。經(jīng)方法學(xué)考核，批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為6.19%和8.10%，發(fā)酵液上清回收率為98.13%～102.94%，與IL-2、HSA基本無(wú)交叉反應(yīng)，健全性分析表明發(fā)酵液及小鼠血清稀釋倍數(shù)對(duì)該方法無(wú)影響，穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示預(yù)包被酶標(biāo)板可在4℃下穩(wěn)定存在3個(gè)月以上。將該方法用于發(fā)酵和純化過(guò)程中的融合蛋白的檢測(cè)，可以有效檢測(cè)目的蛋白的含量，為發(fā)酵和純化工藝的優(yōu)化提供了必要的數(shù)據(jù)支持，并為后期