新型融合抗菌肽基因的構(gòu)建及表達(dá)活性研究.pdf

1、為探索構(gòu)建廣譜高效的抗感染新型制劑，本實驗應(yīng)用重疊區(qū)PCR（overlapextension PCR）技術(shù)構(gòu)建了ESC、citropin1.1和DHV4三種抗菌肽（分別略寫為ESC、CITI和DHV4）的融合基因（命名為ECD）。為了保證結(jié)構(gòu)域不相互干擾，在融合基因中加入了由甘氨酸和絲氨酸組成的柔性連接肽序列（Gly+Gly+Gly+Ser+Gly+Gly+Ser和Gly+Gly+Ser+Gly+Gly+Ser+Gl），并用軟件ANTH

2、EPROT 5.0對其序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整?？紤]到原核表達(dá)時大腸桿菌對密碼子的偏好性，本實驗對融合肽基因序列作了同義突變，設(shè)計并合成了四條70bp左右的片段，采用重疊區(qū)PCR法，利用高保真Pfu DNA聚合酶擴增出融合肽基因。 構(gòu)建了pGEX-4T-1-ECD（略為pG-ECD）原核表達(dá)載體并作BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切、質(zhì)粒PCR和測序驗證。將正確構(gòu)建的融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和BL21（DE3），用2x YTA

3、培養(yǎng)基培養(yǎng)，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，作SDS-PAGE分析表達(dá)情況。結(jié)果表明，該GST-融合蛋白分子量為33kD，與預(yù)測的大小相符；該融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中、0.5mmol/LIPTG和28℃誘導(dǎo)溫度下表達(dá)效果最好，但表達(dá)量與pGEX-4T-1空對照相比相對較少；其表達(dá)量在4 h內(nèi)與誘導(dǎo)時間成正相關(guān)；同時該融合蛋白主要以可溶形式存在。為進(jìn)一步研究其誘導(dǎo)表達(dá)條件及生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 融合基因表達(dá)培養(yǎng)液經(jīng)破碎裂解得到

4、融合蛋白上清粗制品，用Glutathione Sepharose 4B親和層析柱吸附，PBS緩沖液溫育洗脫后，在96孔板上初步檢測該融合蛋白對四種標(biāo)準(zhǔn)菌株――大腸桿菌（Escherichiacoli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC26112、肺炎鏈球菌（Streptococcus penumoniae）ATCC49619和綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa）AT