米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化與催化活性研究.pdf

1、果糖基轉(zhuǎn)移酶能夠催化果糖基單元從一個(gè)蔗糖分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)分子蔗糖的一類酶（EC2.4.1.9），屬于胞外內(nèi)切酶，該類酶屬于糖苷水解酶32（GH32）和68（GH68）的家族。微生物來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性高，耐受高溫，且不受季節(jié)限制，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。三氯蔗糖作為一種新型非營養(yǎng)型低聚果糖，具有甜度高，味質(zhì)好，無熱量和安全性高的功能，且具有良好的理化性質(zhì)，耐熱，耐酸，適用于培烤食品、飲料、糖果和醫(yī)藥制劑中，是迄今為止人類開發(fā)的一

2、種最完美最有競(jìng)爭(zhēng)力的強(qiáng)力甜味劑，在現(xiàn)有的合成途徑中，蔗糖-6-乙酸酯是三氯蔗糖合成的關(guān)鍵中間體。生物酶法制備蔗糖-6-乙酸酯是近年來研究熱點(diǎn)，以蔗糖與葡萄糖-6-乙酸酯為底物，經(jīng)果糖基轉(zhuǎn)移酶催化作用生成蔗糖-6-乙酸酯。該方法具有高效專一性、副產(chǎn)物少，轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用潛力極大。
　　本文首先在我們前期試驗(yàn)中，從一株米曲霉發(fā)酵液的中篩選到一種新型的果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT，發(fā)現(xiàn)其粗酶具有較高催化合成蔗糖-6-乙酸酯的活性。為了得到純

3、化的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT，發(fā)酵液經(jīng)過硫酸銨沉淀法、Q-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠過濾等步驟，獲得純化的的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，顯示為單一條帶，分子量約為50 kDa；經(jīng)過MALDI-TOF MS分析該酶的肽指紋圖譜，表明該酶AoFT具有GH32家族的保守活性中心序列FRDPXVFW和GXXXECPX；通過HPLC和LC-MS檢測(cè)純化果糖基轉(zhuǎn)移酶Ao

4、FT活性，發(fā)現(xiàn)該酶具有較高轉(zhuǎn)果糖基活性，將蔗糖分子中果糖基轉(zhuǎn)移至葡萄糖-6-乙酸酯，生成蔗糖-6-乙酸酯和葡萄糖。
　　對(duì)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的研究。發(fā)現(xiàn)該酶最適反應(yīng)溫度和最適pH分別為45℃和6.0，在溫度范圍30-50℃處理1 h可以保持80％活性以上；果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT還具有較高的pH穩(wěn)定性，在pH4.5-7.5之間處理1 h可以保持80%活性以上。此外，該酶對(duì)大多數(shù)的金屬離子、表面活性劑（Twe

5、en20、Triton-X100）和有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、甲醛、DMF、DMSO等）具有較好的抗性。變形劑SDS和尿素對(duì)該酶活性抑制作用較強(qiáng)，但是該酶轉(zhuǎn)糖基活性不受EDTA抑制，表明該酶不是金屬酶。
　　初步分析了米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶 AoFT在不同屬性離子液體中的催化活性，發(fā)現(xiàn)了果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT在不同的離子液體中催化活性不同。在六氟磷酸鹽類離子液體轉(zhuǎn)糖基活性具有明顯激活作用，尤其在[Dmim][PF6]的離子液體

6、中蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率提高到30.5%，在四氟硼酸鹽類離子液體轉(zhuǎn)糖基活性具有明顯抑制作用，[OmPy][BF4]的離子液體中蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率降到3.73%，但在其他的離子液體中該酶的活性變化不大。利用傅里葉變換紅外光譜FT-IR和圓二色譜法CD對(duì)酶AoFT分子構(gòu)象中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT在離子液體中二級(jí)結(jié)構(gòu)變化與催化活性緊密相關(guān)。發(fā)現(xiàn)在疏水性的六氟磷酸鹽類離子液體中酶的α-螺旋含量降低，β-折疊含量越升高，酶的催化活