人類補體調節(jié)因子殼聚糖納米微囊混合物體外及體內的初步實驗研究.pdf

1、肝病是目前威脅人類健康的主要疾病之一，由于各種肝病導致的急、慢性肝功能衰竭，所致病死率高達70％～80％，多項研究表明，治療急性肝功能衰竭及終末期肝病唯一有效手段是肝臟移植，但由于供體來源困難，在很大程度上限制了肝移植技術的廣泛應用。異種肝臟移植是目前該領域研究的重點課題，而應用該方法移植的主要障礙是超急性排斥(Hyperacuterejection，HAR)，其本質是人類補體激活所造成的供體器官不可逆損傷、破壞。人類自身存在許多補體調

2、節(jié)因子(complementregularfactor，CRF)，其中最有效的有衰變加速因子(decayacceleratingfactor，DAF)、CD59、膜輔助蛋白(membranecofactorprotein，MCP)。它們之間相互作用，一起有效控制補體的活化，保護宿主細胞免受補體介導的殺傷。 本課題組自2001年以來一直從事肝臟非病毒載體基因轉移技術的研究，曾利用納米微囊(nanosphere)包裹Lucifera

3、se報告基因，成功地制備出納米微囊-報告基因復合體，通過體內、外轉染大鼠肝細胞，對合成的載體進行了體內外的初步生物評價，認為殼聚糖(chitosan，CS)可以有效地介導基因轉染細胞。在此研究基礎上，我們構建人類CRF(DAF、CD59、MCP)真核表達載體，制備CS-DNA納米微囊混合物，并進行了一系列體內、外的初步實驗研究，以期觀察人類DAF、CD59、MCP對異種細胞的保護作用，并為下一步的人工肝臟研究打下基礎。 目的:通

4、過CS納米微囊載體進行人類CRF(DAF、CD59、MCP)的體外及體內基因轉染，并觀察人類DAF、CD59、MCP對異種組織細胞的保護作用。 方法:構建人類DAF、CD59、MCP真核表達載體pSecTag2/HygroB-DAF、pSecTag2/HygroB-CD59、pSecTag2/HygroB-MCP；利用CS組裝成納米微囊混合物，體外轉染小鼠成纖維細胞系(NIH3T3)細胞24h，免疫組織化學法檢測細胞轉基因表達水

5、平；用含有5％、10％人血清的DMEM分別培養(yǎng)未轉染及轉染CS-DNA(CS-DAF、CS-CD59及CS-MCP)納米微囊混合物的NIH3T3細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，MTT比色法檢測細胞活性，同時結合形態(tài)學及細胞增殖活性比較，對CS的毒性進行探討；CS-DNA納米微囊混合物經(jīng)耳緣靜脈注射，體內轉染新西蘭兔48h，利用免疫組織化學法檢測肝臟轉基因表達水平，同時結合形態(tài)學及細胞增殖活性比較，對CS的毒性進行探討；進行離體肝臟灌注

6、實驗研究，為下一步DAF、CD59、MCP基因轉染離體異種肝臟的研究打下基礎。 結果:DAF基因大小為1049bp，MCP基因大小為1065bp，CD59基因大小為312bp，與genbank中記載的人DAF、MCP和CD59cDNA序列結果基本相同?？笵AF/CD59/MCP免疫組織化學染色結果顯示：轉染CS-DAF/CS-CD59/CS-MCP納米微囊混合物后的NIH3T3細胞、兔肝組織均呈現(xiàn)彌漫性陽性，其中轉染24h的NI

7、H3T3細胞的陽性部位主要位于細胞質；轉染48h的兔肝組織陽性部位主要位于細胞核。在形態(tài)學上，轉染CS-DNA納米微囊混合物后的肝組織及NIH3T3細胞，較轉染前無明顯差別；在細胞增殖活性上，轉染CS-DNA納米微囊混合物的肝組織及NIH3T3細胞，較轉染前略有增高。MTT比色法結果顯示：未轉染CS-DNA混合物的各分組，經(jīng)5％、10％人血清DMEM培養(yǎng)的活細胞數(shù)，較常規(guī)含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)組明顯減少(P＜0.01)；10％人血

8、清DMEM培養(yǎng)組的活細胞數(shù)明顯低于5％人血清DMEM培養(yǎng)組(P＜0.01)；轉染CS-DNA混合物的各分組間，存活細胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05)；經(jīng)5％、10％人血清DMEM培養(yǎng)的兩個分組之間，存活細胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05)。流式細胞儀結果顯示：未轉染CS-DNA納米微囊混合物的NIH3T3細胞經(jīng)常規(guī)含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)，細胞凋亡率為0.8％；轉染CS-DNA納米微囊混合物的細胞經(jīng)5％人血清、10％人血清DMEM培養(yǎng)，細

9、胞凋亡率為1.3％及1.8％；經(jīng)5％、10％人血清DMEM培養(yǎng)的未轉染細胞，細胞凋亡率分別為20％和46.9％；經(jīng)10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)的轉染CS-DNA納米微囊混合物NIH3T3細胞，凋亡率為1％。不同時間下，離體灌注的肝臟HE染色結果顯示：與正常肝組織相比，灌注后2h肝細胞即出現(xiàn)糖原消耗現(xiàn)象，表現(xiàn)為細胞質淡染、出現(xiàn)空泡樣變；4h肝細胞糖原消耗進一步加重，細胞質空泡樣變更為明顯，且發(fā)生空泡樣變的細胞數(shù)目明顯增多，甚至偶見小灶狀的肝

10、細胞壞死；8h肝細胞壞死灶逐漸增多，局部肝板斷裂；16h壞死灶明顯增大，肝板廣泛斷裂；24h肝細胞廣泛壞死，但細胞核殘存；32h肝細胞廣泛凝固性壞死，細胞核消失。 結論:成功構建了人類DAF、CD59、MCP真核表達載體pSecTag2/HygroB-DAF、pSecTag2/HygroB-CD59、pSecTag2/HygroB-MCP。CS是一種較為有效、安全、無毒的非病毒類DNA載體，對細胞的增殖活性不會造成很大的影響。利

11、用CS轉染組織、細胞24h，主要呈現(xiàn)細胞質陽性，可能與細胞攝取CS-DNA納米微囊后形成內涵體，并從內涵體釋放入細胞質有關；轉染48h，主要呈現(xiàn)細胞核陽性，說明CS-DNA納米微囊可以在細胞核內大量聚集。通過靜脈注射可以有效地將CS-DNA混合物轉染肝臟組織。人血清對小鼠NIH3T3細胞具有明顯的殺傷及誘導凋亡的作用，10％人血清殺傷作用明顯高于5％人血清，可能與高濃度血清中含有的補體成分含量增多有關。利用CS將人類DAF、CD59、M