新型納米微囊復(fù)合體介導(dǎo)大鼠肝靶向基因轉(zhuǎn)染體外及體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)納米微囊-報(bào)告基因復(fù)合體,體內(nèi)外轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞,探索其應(yīng)用于臨床肝靶向基因治療可行性.該試驗(yàn)分別利用納米微囊(Nanosphere)包裹Luciferase報(bào)告基因,作為基因治療的肝靶向載體,以提高肝靶向載體的表達(dá)效價(jià),并對合成的載體進(jìn)行了體內(nèi)外的初步生物評價(jià).目的:探討納米微囊載體應(yīng)用于大鼠體外及體內(nèi)基因治療的可行性,安全性、轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平、轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)移方法并與質(zhì)粒DNA進(jìn)行比較.方法:以熒光素酶(luciferase,V

2、R1255)、綠色熒光蛋白(EGFP)為目的基因,分別利用納米微囊PEI(聚已烯亞胺),Chitosan(殼聚糖)自組裝成納米微囊復(fù)合體,檢測其物理化學(xué)特性,體外轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2,Hep3B,Huh-7及原代大鼠肝細(xì)胞(Hepatocyte),Kupffer細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平,流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染效率,MTT法檢測對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的毒性.體內(nèi)通過門靜脈、膽管及尾靜脈灌注,檢測3、7、1

3、4天大鼠肝臟轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平,不同肝葉轉(zhuǎn)基因表達(dá)分布,不同組織器官的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平;肝功能檢測納米微囊復(fù)合體對肝細(xì)胞的毒性;流式細(xì)胞儀檢測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率;膽管灌注納米微囊包裹Cy5標(biāo)記的質(zhì)粒DNA,通過共聚焦顯微鏡觀察納米微囊復(fù)合體在體內(nèi)的分布,及細(xì)胞特異性內(nèi)吞,PCR及RT-PCR,檢測一月后的轉(zhuǎn)基因大鼠DNA及RNA的表達(dá)水平.應(yīng)用特異性KC清除劑如脂質(zhì)體包裹的二氯亞甲基二磷酸鹽及氯化釓(gadolinium chloride,GdC1