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文檔簡介
1、該實驗設計納米微囊-報告基因復合體,體內外轉染大鼠肝細胞,探索其應用于臨床肝靶向基因治療可行性.該試驗分別利用納米微囊(Nanosphere)包裹Luciferase報告基因,作為基因治療的肝靶向載體,以提高肝靶向載體的表達效價,并對合成的載體進行了體內外的初步生物評價.目的:探討納米微囊載體應用于大鼠體外及體內基因治療的可行性,安全性、轉基因表達水平、轉染效率、轉移方法并與質粒DNA進行比較.方法:以熒光素酶(luciferase,V
2、R1255)、綠色熒光蛋白(EGFP)為目的基因,分別利用納米微囊PEI(聚已烯亞胺),Chitosan(殼聚糖)自組裝成納米微囊復合體,檢測其物理化學特性,體外轉染肝癌細胞系HepG2,Hep3B,Huh-7及原代大鼠肝細胞(Hepatocyte),Kupffer細胞,內皮細胞,轉染48小時后檢測細胞轉基因表達水平,流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白表達轉染效率,MTT法檢測對轉基因細胞的毒性.體內通過門靜脈、膽管及尾靜脈灌注,檢測3、7、1
3、4天大鼠肝臟轉基因表達水平,不同肝葉轉基因表達分布,不同組織器官的轉基因表達水平;肝功能檢測納米微囊復合體對肝細胞的毒性;流式細胞儀檢測體內轉染效率;膽管灌注納米微囊包裹Cy5標記的質粒DNA,通過共聚焦顯微鏡觀察納米微囊復合體在體內的分布,及細胞特異性內吞,PCR及RT-PCR,檢測一月后的轉基因大鼠DNA及RNA的表達水平.應用特異性KC清除劑如脂質體包裹的二氯亞甲基二磷酸鹽及氯化釓(gadolinium chloride,GdC1
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