加替沙星—殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜的制備及其體外實驗研究.pdf

1、目的：
　　制備一種新型生物多功能復(fù)合材料—加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜，并進行形態(tài)學(xué)觀察，初步研究其體外釋藥性能及抑菌作用，為該復(fù)合材料的研制及進一步臨床試用奠定基礎(chǔ)。
　　本實驗分為三部分：
　　實驗一：加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜的制備
　　實驗二：加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜的體外緩釋研究
　　實驗三：加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜的體外抑菌實驗方法
　　實驗一：采用離子

2、交聯(lián)法制備加替沙星-殼聚糖納米?；鞈乙?，離心后凍干成粉末，并測定納米粒的粒徑、載藥量和包封率。稱取一定量加替沙星-殼聚糖納米粒凍干粉以適量去離子水稀釋，并根據(jù)其包封率，調(diào)整其中加替沙星的濃度為15mg/ml；分別向0.4ml纖維蛋白原溶液(A液)及0.4ml凝血酶溶液(B液)中加入0.1ml上述加替沙星-殼聚糖納米粒凍干粉溶液，充分混勻后將A，B兩液同時均勻地噴涂于羊膜的基底面，即得加替沙星終濃度為3mg/ml的加替沙星-殼聚糖納米粒膠

3、聯(lián)羊膜藥膜。光鏡及掃描電鏡進行形態(tài)學(xué)觀察。
　　實驗二：將制備好的加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜放入裝有5ml無菌生理鹽水的無菌試管中，置于35℃恒溫培養(yǎng)搖床中搖蕩，每24小時置換1次生理鹽水，連續(xù)15天收集浸出液，置-20℃冰箱中冷凍保存待測。共進行5次平行實驗。按照實驗一的方法，用加替沙星原料藥溶液制成加替沙星膠聯(lián)羊膜藥膜作為對照組。
　　實驗三：采用微量肉湯稀釋法檢測加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜的體外抑菌活性

4、。將增菌后的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌液用生理鹽水調(diào)整濃度至0.5麥氏比濁管標(biāo)準(相當(dāng)于1.0×108CFU/ml)，再用MH肉湯稀釋為1.0×105CFU/ml濃度用于接種。倍比稀釋加替沙星原料藥和加替沙星-殼聚糖納米粒溶液為32～0.03μg/ml11個濃度。在96孔無菌培養(yǎng)板第1-2排1-11孔分別加入100μl倍比稀釋后不同濃度的加替沙星原料藥溶液，第3-5排1-11孔分別加入100μl倍比稀釋后不同濃度的加替沙星-殼聚糖納

5、米粒溶液，第6-8排1-11孔分別加入100μl對倍稀釋后的第5-15天的加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜浸出液，每排最后1孔(第12孔)作為不加藥的生長對照孔；最后將制備好的接種物加到微孔板中，每孔100μl。35℃孵育16～24h觀察結(jié)果。
　　結(jié)果
　　實驗一：加替沙星-殼聚糖納米粒粒徑為291±33nm，載藥量為10.46％，包封率為61.32％。加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜在肉眼下為白色半透明薄膜，有一定柔

6、韌性和可塑性，羊膜與載納米藥物的纖維蛋白膠粘合緊密。蘇木精-伊紅染色光鏡下觀察，可見羊膜結(jié)構(gòu)完整，無明顯皺縮，羊膜上皮面可見單層柱狀上皮細胞，羊膜基底面與纖維蛋白膠粘合緊密，纖維蛋白膠厚度、著色較為均一，并可見膠原纖維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。掃描電鏡下觀察，清楚可見膠原纖維排列成的三維交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，加替沙星-殼聚糖納米粒成簇地附著在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，納米粒呈圓形，粒徑大小為250nm左右。
　　實驗二：在體外條件下加替沙星膠聯(lián)羊膜藥膜的釋放非常緩慢

7、，可持續(xù)釋藥7d，早期釋放相對較快，24h累計釋放率為(68.34±1.61)％，以后釋藥逐漸緩慢，72h累計釋放率為(92.52±2.33)％，此后釋藥趨于平衡；相比之下，加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜的釋藥速度更加緩慢，24h只釋放了(25.27±3.07)％，72h的累計釋放率也僅為(55.66±2.98)，且可持續(xù)釋藥達15d。
　　實驗三：加替沙星原料藥組、加替沙星-殼聚糖納米粒組及加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜

8、浸出液組對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度值分別為0.063μg/ml、0.03μg/ml和0.05μg/ml；對銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度值分別為1μg/ml、0.25μg/ml和0.42μg/ml。
　　結(jié)論
　　1、載加替沙星-殼聚糖納米粒的纖維蛋白膠與羊膜能穩(wěn)定膠聯(lián)制成加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜，該材料制備工藝可控，具有較穩(wěn)定的生物物理學(xué)性能。
　　2、加替沙星-殼聚糖納米粒膠聯(lián)羊膜藥膜在體外具有良好的緩釋