大黃油菜粒色性狀候選基因的定位克隆及功能分析.pdf

1、白菜型油菜（Brassica rapa L,2n=20, AA)為十字花科蕓薹屬作物，屬于栽培油菜基本種。我國是白菜和白菜型油菜的起源中心，與甘藍(lán)型油菜相比，其起源和栽培歷史悠久，遺傳資源豐富，具有天然而穩(wěn)定的黃籽資源。目前，已有大量研究表明，與普通黑褐籽油菜相比，黃籽油菜具有油質(zhì)清澈、脂肪和蛋白質(zhì)含量高、皮殼率低、餅粕飼用價值高、且單寧等有毒物質(zhì)含量低的優(yōu)點。因此，黃籽作為優(yōu)良油菜品種的一種重要的指示性狀受到人們的重視，黃籽油菜品種的

2、選育一直是重要的育種目標(biāo)。本研究通過全基因組重測序結(jié)合遺傳連鎖圖譜對白菜型黃籽油菜大黃的粒色基因進(jìn)行了精細(xì)定位，并對粒色候選基因進(jìn)行克隆及功能分析，初步鑒定了控制大黃粒色的目標(biāo)基因。此外，研究了黃褐籽種子形成過程中種皮色澤的動態(tài)變化規(guī)律及類黃酮代謝中目標(biāo)基因及其他相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因的差異表達(dá)。揭示了白菜型油菜種皮中色素在種子發(fā)育時期的積累規(guī)律，為候選基因與類黃酮途徑其他各基因的調(diào)控機(jī)理提供初步線索。主要研究結(jié)果如下：
　　1.

3、精細(xì)定位大黃油菜粒色基因，在前人對大黃油菜粒色基因定位的基礎(chǔ)上，通過新開發(fā)得到的8個特異性SSR分子標(biāo)記及實驗室已開發(fā)7個特異性標(biāo)記，進(jìn)一步加密遺傳連鎖圖譜，并得到整合后的物理圖譜，將目標(biāo)基因鎖定在A9染色體上一段1.08Mb（A9:18.26Mb-19.34Mb）區(qū)間。
　　通過全基因組重測序定位大黃油菜粒色基因，結(jié)果顯示三個候選區(qū)段位于A9染色體上（17.83 Mb-18.93 Mb;20.53 Mb-20.99 Mb;22.

4、57 Mb-26.09 Mb）。其中，重測序定位所得候選區(qū)段之一（17.83 Mb-18.93 Mb）與遺傳連鎖圖譜定位結(jié)果存在大段重疊(overlap)，并且該重疊區(qū)段內(nèi)包含5個與目標(biāo)基因共分離的連鎖標(biāo)記。結(jié)合分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的方法和全基因組重測序的定位方法將目標(biāo)基因所在區(qū)間縮短為678 Kb(A9:18.26 Mb-18.93 Mb)。
　　2.大黃油菜粒色候選基因Brtt1的克隆及序列分析，在BRAD數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)

5、候選區(qū)間（A9:678Kb）共包含46個候選基因。通過與擬南芥全基因組序列的同源比對，并參考這46個候選基因同源基因的功能注釋，分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)段僅包含一個與色素合成相關(guān)的候選基因 BrTT1(Bra028067)，其擬南芥同源基因為功能已知的類黃酮途徑關(guān)鍵基因 TT1(At1g34790)。且在擬南芥中 TT1基因突變體表現(xiàn)為透明種皮的性狀，推測BrTT1基因為大黃油菜粒色基因的關(guān)鍵候選基因。
　　利用白菜基因組序列，擴(kuò)增獲得BrT

6、T1全長序列4586bp，其中包含啟動子片段1796bp，終止子下游序列986bp，編碼區(qū)序列1804bp，該基因包含有2個外顯子和1個內(nèi)含子。與白菜基因組序列BrTT1參考序列不同的是，該序列在起始密碼子上游39bp處提前編碼，導(dǎo)致白菜型油菜褐籽中BrTT1序列的第一外顯子比參考序列多39堿基，但未引起移碼突變。
　　等位基因序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃籽Brtt1與褐籽BrTT1的啟動子序列完全一致，與褐籽序列相比，黃籽材料中Brtt

7、1在外顯子區(qū)存在7處堿基替換，內(nèi)含子區(qū)存在13處SNP位點，且存在2bp、9bp、114bp片段缺失。進(jìn)一步進(jìn)行氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)大黃材料Brtt1編碼蛋白序列有4處氨基酸同義突變，有3處氨基酸有義突變，分別為 N45H、S294Y、H299L。
　　將BrTT1基因編碼氨基酸序列提交至ExPASy數(shù)據(jù)庫(http://www.expasy.org)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示BrTT1編碼WIP鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其分子式為C

8、145C148H161H165，屬于C2H2類型鋅指蛋白。
　　3.大黃油菜粒色候選基因BrTT1的遺傳轉(zhuǎn)化，利用花絮浸染農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將BrTT1基因全長轉(zhuǎn)入擬南芥tt1突變體CS82中，共得到20株T1代陽性苗，粒色完全恢復(fù)為野生型種皮顏色褐色，且恢復(fù)率為100％。將 T1代陽性苗轉(zhuǎn)化株繼代至 T3代苗，粒色性狀表現(xiàn)穩(wěn)定。BrTT1基因能夠完全恢復(fù) tt1突變體粒色性狀，使其表現(xiàn)為野生型粒色性狀。BrTT1基因與擬

9、南芥同源基因TT1有相似的基因功能，參與類黃酮代謝途徑。
　　分別擴(kuò)增黃褐籽 BrTT1全長 ORF序列，構(gòu)建超量表達(dá)載體 p35S::TT1與p35S::tt1，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸染的方法分別轉(zhuǎn)化擬南芥tt1突變體CS82。載體p35S::TT1所得31株T1代陽性苗，且種子粒色完全恢復(fù)至野生型種子粒色，載體p35S::tt1所得39株T1代陽性苗，種子粒色與突變體CS82粒色相近，仍為亮黃色。
　　構(gòu)建 BrTT1亞

10、細(xì)胞定位載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片下表皮細(xì)胞和洋蔥內(nèi)皮層細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，瞬時表達(dá)BrTT1：GFP融合蛋白，將BrTT1定位于細(xì)胞核中，這符合轉(zhuǎn)錄因子的特征。
　　4.黃褐籽不同發(fā)育時期種皮中色素積累規(guī)律與候選基因BrTT1及類黃酮代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)，通過體視鏡觀察并比較黃褐籽材料種子形成過程中種皮色澤變化，種子發(fā)育中期（授粉后28天、35天）黃褐籽材料的粒色性狀差異較大，褐籽材料種皮色澤明顯變?yōu)楹稚S籽材料在整個種子發(fā)育

11、過程并未存在粒色性狀的較大變化，表現(xiàn)為透明種皮，呈現(xiàn)種胚的顏色。
　　通過qRT-PCR分析可知，候選基因BrTT1的主要表達(dá)部位在種子形成時期，且種子形成前期和中期（授粉后7天、14天、21天、28天、35天）黃褐籽材料中BrTT1的表達(dá)量達(dá)到極顯著差異，褐籽表達(dá)量顯著高于黃籽。在授粉后21天褐籽材料中BrTT1的表達(dá)量達(dá)到最高峰值，但在種子形成后期（授粉后49天） BrTT1在黃褐籽材料中的表達(dá)量并未達(dá)到極顯著差異。
　

12、　對大黃油菜粒色性狀候選基因BrTT1及類黃酮代謝途徑其他相關(guān)的8個結(jié)構(gòu)基因和6個轉(zhuǎn)錄因子在黃褐籽種子形成不同時期材料中的表達(dá)量進(jìn)行熱圖分析和表達(dá)譜分析，BrTT3、BrTT18、BrBAN在黃褐籽材料中表達(dá)差異較大，且褐籽材料中檢測到這些基因的大量表達(dá)，而在黃籽材料中幾乎不表達(dá)。結(jié)合已有對其他植物中 TT1的研究結(jié)果，初步推斷白菜型油菜種皮中類黃酮代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致黃褐籽種皮粒色差異的根本原因。粒色性狀候選基因BrTT1