家族性發(fā)作性疼痛致病基因的定位克隆及功能研究.pdf

1、痛覺是有機(jī)體內(nèi)部的警戒系統(tǒng)，防御有機(jī)體受到進(jìn)一步傷害和促進(jìn)損傷組織愈合，但是慢性疼痛的發(fā)生預(yù)示人體體質(zhì)下降或其他部位可能出現(xiàn)健康危機(jī)。目前，慢性疼痛仍然是重要的臨床挑戰(zhàn)，世界上約10％的人口受疼痛困擾，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量。
　　疼痛由一種適宜的刺激（如機(jī)械、溫度和化學(xué)試劑）作用于傷害性感受器，引起感覺神經(jīng)元去極化，通過傷害性感受器將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)（傷害性信息），循相應(yīng)的傳入神經(jīng)(Aδ和C纖維)，釋放痛信號(hào)傳遞物質(zhì)(如P物

2、質(zhì)，谷氨酸)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，經(jīng)脊髓、腦干、間腦后到大腦邊緣系統(tǒng)和大腦皮質(zhì)，經(jīng)過各級(jí)中樞整合后產(chǎn)生疼痛感覺和疼痛反應(yīng)。人類疼痛分為急性疼痛和慢性疼痛，急性痛是人體免受傷害，是組織損傷的生理性預(yù)警信號(hào)。然而慢性疼痛是一種病理狀態(tài)，依據(jù)疼痛病理機(jī)制，慢性疼痛可分為傷害性或炎癥性疼痛和神經(jīng)性疼痛。神經(jīng)性疼痛一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題，發(fā)病機(jī)理不是十分清楚。人類單基因遺傳性疼痛機(jī)制的研究為探討正常和病理?xiàng)l件下疼痛的分子機(jī)制提供重要途徑。
　　

3、本文收集并鑒定了兩個(gè)來自中國(guó)常染色體顯性家族性發(fā)作性疼痛家系，這兩個(gè)家系共69人28位患者。兩個(gè)家系患者疼痛特征相似，疼痛部位主要位于下肢遠(yuǎn)端，偶發(fā)在上肢的肘關(guān)節(jié)、指關(guān)節(jié)和掌心；周期性疼痛發(fā)作時(shí)間常在午后，陰雨天、換季、疲勞和身體虛弱（如感冒過后）常可誘發(fā)；幼年發(fā)生頻繁，隨著年齡的增長(zhǎng)，疼痛發(fā)作次數(shù)、發(fā)作周期、疼痛程度等減少；疼痛時(shí)伴隨出汗以及疼痛部位發(fā)涼，熱敷疼痛稍緩解，但疼痛嚴(yán)重時(shí)口服抗炎去痛藥可以快速緩解疼痛。
　　獲得患者

4、的知情同意，對(duì)這兩個(gè)家系進(jìn)行遺傳分析，排除三個(gè)離子通道基因SCN9A, TRPA1和SCN10A（它們的獲得功能突變可以導(dǎo)致類似的神經(jīng)發(fā)作性疼痛）是導(dǎo)致這兩個(gè)家系患者的發(fā)病原因。利用全基因組微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)其中一個(gè)疼痛家系（命名為JLTH家系）連鎖分析，將該家系的致病基因定位在3號(hào)染色體3p22.3-p21.32之間大約7.81Mb的區(qū)域。隨后對(duì)第二個(gè)疼痛家系（命名為HBBJ家系）進(jìn)行連鎖，發(fā)現(xiàn)該家系的致病基因也定位于上述區(qū)段。進(jìn)一步利用全

5、外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)JLTH家系先證者測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)定位區(qū)段內(nèi)SCN11A發(fā)生一個(gè)錯(cuò)義突變c.673C>T，該突變?cè)斐善渚幋a的蛋白Nav1.9第225位精氨酸變?yōu)榘腚装彼幔╬.Arg225Cys），隨即對(duì)HBBJ家系先證者Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)SCN11A基因另一個(gè)錯(cuò)義突變c.2423C>G，該突變?cè)斐蒒av1.9第808位的丙氨酸變?yōu)楦拾彼幔╬.Ala808Gly）。利用限制性長(zhǎng)度片段多肽技術(shù)驗(yàn)證這兩個(gè)突變分別在各自的家系中與疼痛表型共

6、分離，分別在1021例家系外正常人群中不存在上述突變。對(duì)Nav1.9通道生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Nav1.9通道p.Arg225和p.Ala808這兩個(gè)氨基酸在進(jìn)化中高度保守，同時(shí)在人類鈉通道家族不同亞型中也高度保守。因此，從遺傳上證明了SCN11A基因突變是導(dǎo)致家族性發(fā)作性疼痛疾病的原因。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，構(gòu)建了SCN11A野生型和突變體真核表達(dá)載體。利用電轉(zhuǎn)染的方法把SCN11A不同載體轉(zhuǎn)染急性分離的小鼠DRG神經(jīng)元中

7、過表達(dá)，進(jìn)行電生理特性分析，與野生型相比，p.Arg225Cys和p.Ala808Gly的峰電流密度在-50mV分別增加了23％和30％，峰電流密度增加預(yù)示著兩個(gè)突變體DRG神經(jīng)元有較高的電活性。在相同電流刺激下，p.Arg225Cys和p.Ala808Gly突變DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放頻率比野生型明顯增多，并且p.Ala808Gly突變比p.Arg225Cys突變動(dòng)作電位發(fā)放次數(shù)更多。電生理結(jié)果顯示SCN11A基因突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜鈉離