杉木種質(zhì)資源遺傳分析及無(wú)性系、雜交種ISSR指紋鑒定.pdf

1、杉木[Cunninghamialanceolata(Lemb)Hook]是我國(guó)南方特有的用材樹(shù)種，具有生長(zhǎng)快、材質(zhì)好、產(chǎn)量高和用途廣的特點(diǎn)，在南方林業(yè)生產(chǎn)中占重要地位，進(jìn)行杉木遺傳資源的收集、鑒定和遺傳多樣性分析具有重要現(xiàn)實(shí)意義。多年來(lái)不同學(xué)者對(duì)杉木地理種源遺傳變異規(guī)律進(jìn)行了大量研究，取得了很多研究成果，但目前的研究以不同地理種源杉木的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生態(tài)學(xué)方面的研究居多，從分子生物學(xué)方面進(jìn)行的研究相對(duì)較少，至今仍未從分子機(jī)理上弄清不同

2、種源杉木的遺傳變異規(guī)律及種群分布格局。加上近年來(lái)大量野生杉木種質(zhì)資源被破壞，各地造林的杉木種子的種源、無(wú)性系來(lái)源不清和杉木造林材料管理混亂，目前尚無(wú)法通過(guò)外部形態(tài)、生理學(xué)及細(xì)胞標(biāo)記方法進(jìn)行鑒別。 針對(duì)目前杉木育種工作中存在的以上問(wèn)題，本研究選擇全國(guó)24個(gè)杉木地理種源、9個(gè)杉木優(yōu)良無(wú)性系和6個(gè)親本及其雜交子代為研究材料，首次利用多態(tài)性、重復(fù)性及檢測(cè)遺傳差異能力均優(yōu)于RAPD的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行不同杉木地理種源的遺傳分析及無(wú)

3、性系、雜交種的ISSR指紋鑒定，分析不同種源杉木的遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)及種源間的親緣關(guān)系，探討利用ISSR標(biāo)記技術(shù)鑒別杉木無(wú)性系及雜交種的可行性，從分子水平上揭示不同種源杉木的遺傳變異規(guī)律及種群分布格局，為合理杉木地理種源區(qū)劃和育種方案制定、優(yōu)良無(wú)性系及其雜交種鑒定、純度分析及優(yōu)良種質(zhì)資源管理提供分子方面的依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： (1)針對(duì)杉木含有色素、酚類(lèi)化合物和多糖等物質(zhì)導(dǎo)致DNA提取和純化困難的現(xiàn)實(shí)，采用經(jīng)過(guò)改良的SDS法

4、提取的杉木DNA，不論從數(shù)量還是純度上均可滿(mǎn)足ISSR分析要求，且操作簡(jiǎn)便易行，摸索到了合適的杉木DNA提取方法。 (2)研究建立了杉木ISSR-PCR反應(yīng)的技術(shù)體系。在20ul的反應(yīng)體系中，Mg2+的濃度為1.5mmol/L，TaqDNA聚合酶的用量為1U，引物的濃度為0.75umol/L，dNTP的濃度為100umol/L，模板DNA的濃度為100ng/反應(yīng)，2.0ul10×PCR緩沖液。按照此體系，在94℃預(yù)變性7min，

5、94℃變性30s，在55℃的退火溫度下退火40s，72℃延伸2min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min。 (3)通過(guò)對(duì)100個(gè)引物篩選，共得到了22個(gè)擴(kuò)增帶型清晰、穩(wěn)定的ISSR引物，進(jìn)行杉木種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析；同時(shí)研究中發(fā)現(xiàn)含(AG)8、(AC)8、(CT)8序列的ISSR引物在杉木上擴(kuò)增的多態(tài)性水平較高。 (4)從100個(gè)ISSR隨機(jī)引物中篩選出22個(gè)引物對(duì)24個(gè)杉木種源進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出188條譜

6、帶，其中多態(tài)譜帶173條，占總數(shù)的92.0％。表明杉木不同地理種源具有豐富的遺傳多態(tài)性。聚類(lèi)分析將24個(gè)杉木種源分為五個(gè)類(lèi)群：分布區(qū)中帶東區(qū)生態(tài)型、中帶東南區(qū)生態(tài)型、中帶中區(qū)生態(tài)型、南帶生態(tài)型、北帶生態(tài)型。杉木地理種源遺傳距離聚類(lèi)結(jié)果與地域分布基本一致，表明杉木地理種源具有一定緯向傾群變異性，環(huán)境條件和地理距離隔離是影響杉木地理種源遺傳變異的重要因子。 (5)利用18個(gè)ISSR引物對(duì)9個(gè)杉木無(wú)性系進(jìn)行了ISSR-PCR分析，共得

7、到161條擴(kuò)增帶，其中145條帶表現(xiàn)為多態(tài)帶，占總帶數(shù)的90.06％，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出8.06條清晰的特異條帶。由這18個(gè)引物擴(kuò)增出的片段大部分集中在500bp至2000bp。杉木無(wú)性系間表現(xiàn)出了豐富的遺傳多態(tài)性。僅用引物(CTTCA)3、(AC)8G、(AG)8(CT)A中的任一個(gè)構(gòu)建的指紋圖譜就能將供試的9個(gè)杉木無(wú)性系清楚區(qū)分開(kāi)。18個(gè)引物中大多數(shù)引物兩兩結(jié)合就能夠?qū)?個(gè)杉木無(wú)性系清楚的區(qū)分開(kāi)?？梢?jiàn)ISSR擴(kuò)增的譜帶豐富、多態(tài)水平