骨髓干細胞移植治療心肌梗死后心力衰竭的實驗研究.pdf

1、背景和目的：充血性心力衰竭是心肌梗死后最嚴重的并發(fā)癥，以往的治療手段尚不能使受損的心肌細胞得到有效的修復。干細胞技術(shù)的研究發(fā)展表明，骨髓細胞移植有可能成為治療這類病人的全新方法。但是，以往的研究應用的骨髓間充質(zhì)細胞都是通過培養(yǎng)得到的，因此這種細胞仍存在純度不高、表現(xiàn)不均一、不利于移植后的分化鑒定等缺點，因此有必要對供體細胞進行改建。供體細胞種類不同，引起的心功能改善程度也不一致，何者是移植的最佳供體細胞，目前并無比較研究。動物實驗應用的

2、供體細胞多為人源骨髓干細胞，多為異種移植，這種異種移植是否會影響其療效呢?供體干細胞的改建是影響骨髓干移植療效的主要因素。但是，由于心臟自身的血流灌注狀態(tài)對心梗后骨髓干細胞移植的療效可能也有較大影響，改善供體所在微環(huán)境也可能是提高其療效的關(guān)鍵。本研究旨在探討：(1)從培養(yǎng)的人源骨髓間充質(zhì)細胞分選、純化、擴增得到純化均一的多潛能間充質(zhì)干細胞；(2)觀察這些細胞移植在梗死心肌中對血管新生和心臟功能改善的效果；(3)與目前常用的其他供體細胞比

3、較，觀察經(jīng)純化的骨髓干細胞移植是否更有利于心臟功能改善；(4)通過觀察純化的骨髓干細胞移植后引起缺血心肌中與排斥反應密切相關(guān)的基因HO-1表達情況，探討HO-1與異種移植人源MMSCs到梗死大鼠心臟引起的效應之間相互關(guān)系；(5)通過觀察梗死區(qū)側(cè)枝循環(huán)的建立對冠脈內(nèi)骨髓單個核細胞移植術(shù)心肌修復療效的影響，探討受體心臟微環(huán)境對供體細胞功能的影響。 方法：利用大鼠急性心肌梗死模型和小型豬慢性心肌缺血模型，通過心外膜直視下注射或經(jīng)冠狀動

4、脈內(nèi)注射方式移植骨髓干細胞。超聲心動圖檢測心臟功能和結(jié)構(gòu)的變化；冠脈造影顯像評估側(cè)枝循環(huán)情況；組織病理學顯示心室膠原含量的變化；免疫組化法顯示新生血管數(shù)量、移植細胞的可塑性情況、宿主心肌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)和歸巢因子(SDF-1)的表達情況；RT-PCR、Real-timePCR和Westernblot檢測這些細胞因子或細胞蛋白的mRNA和蛋白表達情況。 結(jié)果：第一部分內(nèi)容，通過制備大鼠心

5、肌梗死模型，采用通過細胞培養(yǎng)與流式分選雙結(jié)合的方法，從培養(yǎng)的人源骨髓間充質(zhì)細胞分選、純化、擴增均一換多潛能間充質(zhì)干細胞(MultipotentMesenchymalStemCells，MMSCs)，同時對其特征進行鑒定，分析其體外和在體的分化能力，觀察這些細胞移植在梗死心肌中對血管新生和心臟功能改善的效果。結(jié)果表明：1.MMSCs陽性表達CD44、CD90和CD147，陰性表達CD34、CD38、CD45、CD71、CD117、CD10

6、6和HLR-DR，并表達干細胞標志蛋白(Oct4，Bmil和ABCG2)，分泌VEGF，5-aza可以誘導這些細胞向心肌細胞分化；而成纖維細胞雖然陽性表達CD44、CD90和CD147，但并不表達Oct4，Bmil和ABCG2，不分泌VEGF，不能被5-aza誘導向心肌細胞分化。2.與成纖維細胞移植或注射鹽水組比較，移植MMSCs明顯促進梗死心臟VEGF表達(mRNA和蛋白水平)，也顯著增加缺血心肌血管新生。3.免疫熒光檢測顯示VEGF

7、表達在移植的MMSCs和受體心肌細胞均表達。4.激光共聚焦顯微鏡顯示移植的MMSCs在移植后14天表達心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞特征性蛋白。 第二部分內(nèi)容，應用磁珠分選和極限稀釋細胞培養(yǎng)方法獲取人源骨髓單克隆間充質(zhì)干細胞(snMSCs)，利用貼壁培養(yǎng)方法得到未純化的骨髓間充質(zhì)細胞(uMSCs)，利用梯度密度離心法得到骨髓單個核細胞(BMMNCs)和外周血單個核細胞(PBMNCs)。流式細胞儀分析所得細胞特性后，將其移植到梗死心臟。術(shù)

8、后90天，應用血流動力學技術(shù)檢測大鼠心臟功能，隨后取材，免疫熒光檢測移植細胞的分化情況和血管密度。結(jié)果顯示：1.snMSCs呈99％以上表達間充質(zhì)干細胞標記蛋白，陰性表達造血細胞標記蛋白。2.移植snMSCs心臟收縮功能較明顯高于其它各組(P＜0.05)。血管計數(shù)顯示，snMSC組血管密度明顯多于其它各組(P＜0.05)。3.移植的snMSCs向心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化效率明顯高于其它骨髓細胞(P＜0.05)，外周血細胞并不發(fā)現(xiàn)分化。

9、 第三部分內(nèi)容，通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備大鼠心肌梗死模型，直視下心外膜注射5×106MSCs或等量PBS溶液；利用免疫熒光、Westernblot和實時定量RT-PCR技術(shù)檢測HSP32在術(shù)后1d、3d和7d的表達變化情況。組織學檢測梗死面積。熒光顯微鏡下觀察DAPI陽性細胞數(shù)量，流式細胞儀分析從心臟中分離出來的DAPI陽性細胞含量。通過超聲心動圖分析心臟功能(EF值和FS值)。結(jié)果顯示：1.缺血心肌中HSP32的表達在移植

10、組明顯增強，并表達于部分移植細胞內(nèi)。2.移植組HSP32表達明顯高于對照組(P＜0.01)，術(shù)后3天達到高峰，明顯高于對照組(P＜0.01)。術(shù)后7天，移植組EF值和FS值明顯高于同期對照組(14％和22％，P＜0.05)。3.HO-1表達上調(diào)同時伴隨DAPI陽性MSCs數(shù)量增加，心肌梗死減少，和缺血心臟功能改善。 第四部分內(nèi)容，結(jié)扎豬心臟左前降支以建立心梗模型，心梗后2周，對模型豬進行梗死區(qū)側(cè)枝循環(huán)Rentrop評分，取分值為

11、0(R0)或1(R1)的模型豬各10頭，心內(nèi)膜下活檢后，然后行冠脈內(nèi)骨髓單個核細胞(2×108cells)移植(BMT)治療，以冠脈內(nèi)注射PBS作對照。即分為R0+BMT、R0+PBS、R1+BMT、R1+PBS共4組，每組各5頭心梗模型豬。結(jié)果表明：1.兩周時，從梗死區(qū)和梗死周邊活檢組織顯示，R1組血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和歸巢因子(SDF-1)表達量明顯高于R0組。R1組血管密度也明顯多于R0

12、組。2.梗死后6周，R1+BMT組Rentrop分值顯著升高，心超檢查發(fā)現(xiàn)R0+BMT、R1+BMT兩組射血分數(shù)(EF)和心肌縮短分數(shù)(FS)均明顯提高，而以R1+BMT組最顯著。3.與心功能檢測和Rentrop評分結(jié)果變化相一致，心梗后6周的血管新生數(shù)量增加、VEGF和bFGF表達量在R1+BMT組是最明顯的。 結(jié)論： 1.從人骨髓分離得到的純化MMSCs可上調(diào)VEGF表達，促進血管新生和提高梗死大鼠心臟功能恢復。