自體骨髓干細(xì)胞移植治療心肌梗死的基礎(chǔ)及臨床研究.pdf

1、背景：長(zhǎng)時(shí)間的心肌血流中斷觸發(fā)了心臟事件的發(fā)生，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞的壞死。從而引起了機(jī)體的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，包括存活心肌細(xì)胞的肥大與增生，以及趨化骨髓來(lái)源的干細(xì)胞至心肌損傷部位來(lái)修復(fù)及促進(jìn)局部新生血管形成。這些修復(fù)機(jī)制中沒有一種能夠完全修復(fù)喪失的心肌以及維持正常的心臟功能。心肌的損傷及其并發(fā)的神經(jīng)內(nèi)分泌的激活導(dǎo)致的左室重構(gòu)，以充血性心力衰竭為臨床表現(xiàn)的發(fā)病率明顯增加。雖然在過(guò)去的十年中慢性心力衰竭的病理生理學(xué)機(jī)制及治療有了重大進(jìn)展，但心衰還

2、是導(dǎo)致了住院率的增加以及預(yù)后不良。單用或聯(lián)合應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑、某些β受體阻滯劑、正確應(yīng)用醛固酮拮抗劑可以顯著降低心衰患者的住院率和病死率。然而，心衰的發(fā)病率與病死率依然很高，這就迫切需要對(duì)心衰的診療有進(jìn)一步的發(fā)展。阻止心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌細(xì)胞再生代表了當(dāng)前治療模式的轉(zhuǎn)換。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一種能夠自我更新、非造血組織的克隆祖細(xì)胞。這些間充質(zhì)干細(xì)

3、胞可以通過(guò)體外培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，并且具有多分化潛能，如分化為：軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)元、骨骼肌細(xì)胞等。一些在體與體外實(shí)驗(yàn)顯示骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞。移植的間充質(zhì)干細(xì)胞直接注入缺血的心肌組織導(dǎo)致了局部血管發(fā)生與心肌形成，但心功能的改善有限。目前尚不清楚移植的干細(xì)胞修復(fù)損傷心肌是通過(guò)成血管細(xì)胞介導(dǎo)的血管發(fā)生、減少了自身心肌細(xì)胞凋亡，還是通過(guò)直接再生喪失的心肌細(xì)胞來(lái)完成的。然而，有研究顯示在豬的心肌梗死模型中移植多達(dá)6×107個(gè)

4、骨髓干細(xì)胞僅產(chǎn)生心功能的輕度改善，這至少是部分因?yàn)橐浦驳母杉?xì)胞生存能力較弱。研究提示在無(wú)損傷的裸鼠心臟中移植的干細(xì)胞在移植4天后大部分死亡。因此應(yīng)用移植的干細(xì)胞來(lái)修復(fù)喪失心肌細(xì)胞的治療策略受到了圍移植期移植細(xì)胞大量死亡的限制。因此，進(jìn)一步促進(jìn)移植的干細(xì)胞存活，減少移植后的凋亡，是提高心功能改善程度的關(guān)鍵步驟，而國(guó)內(nèi)外對(duì)此方面的研究?jī)H見零星報(bào)道。 促紅細(xì)胞生成素(eryrthropoietin，EPO)是促進(jìn)紅細(xì)胞分化及生存的主要

5、細(xì)胞因子，是細(xì)胞生長(zhǎng)因子超家族成員之一，近來(lái)研究顯示EPO具有的多種旁分泌及自分泌功能，維持了血管的自身調(diào)節(jié)，減輕了細(xì)胞凋亡和繼發(fā)性的炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明重組人促紅細(xì)胞生成素(Recombinanthumaneryrthropoietin，rHuEPO)在大腦與脊髓損傷中具有促進(jìn)修復(fù)與再生作用。體內(nèi)的大多數(shù)組織皆表達(dá)EPO受體，尤其在發(fā)育階段，其中包括心臟。因此EPO除具有傳統(tǒng)的促進(jìn)紅細(xì)胞生成作用之外，還具有多效性、能夠影響組織重塑的作用

6、。此外，EPO對(duì)許多種細(xì)胞而言具有抗凋亡作用。近期的一些研究顯示rHuEPO可以對(duì)慢性心力衰竭患者的血流動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生有益的影響。另一方面，有研究證實(shí)rHuEPO可以通過(guò)激活內(nèi)皮祖細(xì)胞的PI3K/AKt信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移以及毛細(xì)血管形成。然而，目前還不十分清楚，rHuEPO對(duì)心肌組織及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所具有的生理作用。綜上所述，聯(lián)合應(yīng)用rHuEPO注射與骨髓干細(xì)胞移植在缺血性心臟病的治療中可能具有協(xié)同或疊加作用。

7、目的：1觀察重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。 2觀察重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷的影響及其相關(guān)機(jī)制探討。3研究rHuEPO能否增強(qiáng)MSCs移植效果并探討其相關(guān)機(jī)制。 4探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。 5研究自體骨髓干細(xì)胞經(jīng)冠脈移植對(duì)心肌梗死患者心功能的影響及其安全性。 方法：1無(wú)血清

8、條件下，不同劑量rHuEPO與MSCs共培養(yǎng)24h。10μ/mlrHuEPO與MSCs共培養(yǎng)72h。 2應(yīng)用MTT方法檢測(cè)MSCs增殖、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。 3通過(guò)缺血再灌注誘導(dǎo)SD乳鼠心肌細(xì)胞凋亡 4缺氧前1h予rHuEPO及rHuEPO預(yù)處理前30min予特異性阻斷劑Wortmannin。 5應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡率、Westernblot測(cè)定p-AKt/AKt比值。 6永久結(jié)扎左

9、冠狀動(dòng)脈前降支制備大鼠心肌梗死模型。 7梗死形成后，在梗死區(qū)域注入移植的骨髓干細(xì)胞。 8圍手術(shù)期每天腹腔注射rHuEPO(3000IU/kg)，共3d，14d后再連續(xù)注射3d。 9術(shù)后2d及21d二維超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能。 10術(shù)后21d免疫組化檢測(cè)Bcl-2、Bax表達(dá)。 11Westernblot檢測(cè)p-AKt/AKt比值。 12采用密度梯度離心法分離人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞

10、。1324例冠心病伴心肌梗死患者，通過(guò)冠脈轉(zhuǎn)運(yùn)將自身骨髓干細(xì)胞植入患者的心肌梗死區(qū)。 14心肌梗死患者干細(xì)胞移植術(shù)前和術(shù)后6個(gè)月分別行99mTc-MIBI心肌灌注顯像、二維超聲心動(dòng)圖和動(dòng)態(tài)心電圖檢查。 結(jié)果：1rHuEPO呈劑量依賴性促進(jìn)MSCs增殖，除0.25u/ml劑量外，其余各組都與對(duì)照組有顯著性差異。 2流式細(xì)胞檢測(cè)表明，rHuEPO組能降低G0/G1期比例，增加S期和G2/M期細(xì)胞比例，與對(duì)照組相比，差

11、異均有顯著性意義。 3rHuEPO可減少缺血再灌注引起的SD乳鼠心肌細(xì)胞凋亡。 4rHuEPO增強(qiáng)了SD乳鼠心肌細(xì)胞p-AKt的表達(dá)。 5Wortmannin抑制了rHuEPO的治療作用。 6術(shù)后2d，各組LVEF無(wú)明顯差異；21d后MI組LVEF明顯降低，而MSC組與EPO組LVEF明顯升高，聯(lián)合治療組LVEF升高更明顯。 7MSC組與EPO組心肌梗死面積較MI組明顯減小；聯(lián)合治療組梗死面積減小

12、更明顯。 8MSCs與rHuEPO能明顯增加缺血心肌的毛細(xì)血管密度，聯(lián)合治療能促進(jìn)毛細(xì)血管密度進(jìn)一步增加。 9術(shù)后21d，MSCs與rHuEPO能明顯改善細(xì)胞存活的指標(biāo)如：增加組織p-AKt/AKt的比值與Bcl-2的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)；聯(lián)合治療則能夠更進(jìn)一步改善這些指標(biāo)。 10采用密度梯度離心法分離的骨髓干細(xì)胞呈球狀，經(jīng)過(guò)48～72h培養(yǎng)后開始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形，生長(zhǎng)緩慢。 1124例患者二維超聲

13、心動(dòng)圖檢查示LVEF較術(shù)前明顯增加；16例99mTc-MIBI檢查顯示梗死部位心肌灌注明顯改善。術(shù)中及術(shù)后隨訪6-23月無(wú)心律失常和其它合并癥發(fā)生。 結(jié)論：1rHuEPO可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，并且這種影響呈劑量依賴性。 2rHuEPO可減少缺血再灌注引起的SD乳鼠心肌細(xì)胞凋亡；PI3K/AKt信號(hào)通路的激活參與了rHuEPO的抗缺血再灌注損傷引起的凋亡作用。 3MSCs移植和rHuEPO注射都可以改善心肌