缺氧復(fù)氧對血管內(nèi)皮細胞t-PA、PAI-1、NO及NOS表達的影響及辛伐他汀的干預(yù)研究.pdf

1、本文研究目的：探討缺氧復(fù)氧對血管內(nèi)皮細胞t一PA、PAI一1、№和№S表達的影響及辛伐他汀的干預(yù)作用，并探討其可能的機制。 研究方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304，使用自制的缺氧小室對ECV304進行缺氧復(fù)氧處理，將細胞培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板和25m1培養(yǎng)瓶。L將ECV304細胞進行缺氧復(fù)氧處理，分別于缺氧2小時、復(fù)氧2、4、8、16小時收集所需標(biāo)本，觀察缺氧復(fù)氧對t一PA、PAI一1、N0、№S活力及e№SmRNA、州0

2、SmRNA、e№S蛋白、表達的影響；2．不同濃度的辛伐他汀(0．1、L0、5．0、10．0μm01幾)以及10．Oumol／L的辛伐他汀+0．2mm0l／L的甲羥戊酸處理ECV304細胞24小時后再行缺氧2小時復(fù)氧2小時處理，收集所需標(biāo)本，觀察辛伐他汀對七一PA、隊卜1、N0和№S活力及eNOSmRNA、州0SmRNA、e№S蛋白表達的影響；3．用10．0umol幾的辛伐他汀預(yù)處理ECV30424小時后再行缺氧2小時、復(fù)氧2、4、8、1

3、6小時處理，收集各時間段細胞培養(yǎng)液，觀察辛伐他汀預(yù)處理對ECV304分泌№和№S活力的影響。4．不同濃度的辛伐他汀(0．1、1．O、10．0μmol幾)以及10．Oμmol／L的辛伐他汀+0．2mm01／L的甲羥戊酸處理ECV304細胞24小時，收集各組細胞標(biāo)本，提取總R№和胞漿蛋白，觀察辛伐他汀對e№SmRNA、州0SmR№、e№S蛋白表達的影響。測定培養(yǎng)液中t呻A、PAI一1濃度用乩ISA法；檢測培養(yǎng)液中NO的含量及№S活力分別用硝

4、酸還原酶法和化學(xué)比色法。收集25ml培養(yǎng)瓶細胞，進行RT一PCR檢測州0S、eNOS基因相對表達量，采用異硫青酸一苯酚一氯仿一步法提取細胞總RNA，純度檢驗合格后，取總RNA做逆轉(zhuǎn)錄生成cDDNA，進行半定量PCR，產(chǎn)物經(jīng)圖象分析系統(tǒng)掃描評價各組州iNOS和e№S基因相對表達量；Western-b1ots檢測e№S蛋白相對表達量，以上各組細胞提取總蛋白，進行SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳，再進行電轉(zhuǎn)膜，用一抗和二抗進行免疫印跡反應(yīng)，顯色，圖

5、象掃描分析，檢測e№S蛋白相對表達量。 研究結(jié)果： 1．復(fù)氧2小時、4小時培養(yǎng)液中t隊濃度明顯增加(P均0．05)，tPA/PAI-1比值明顯

6、增加(P均

7、(P均>O．05)。 3．缺氧2小時、復(fù)氧2小時ECV304eNOSmRNA相對表達量明顯減少(P均

8、組明顯增加(P

9、-1增加；辛伐他汀可減少缺氧復(fù)氧應(yīng)激下血管內(nèi)皮細胞分泌PAI—l，對tPA無影響，增加tPA/PAI-1比值，該作用可被甲羥戊酸逆轉(zhuǎn)。 2．缺氧及復(fù)氧過程中血管內(nèi)皮細胞分泌NO減少、NOS活力下降，辛伐他汀預(yù)處理可使缺氧復(fù)氧過程中內(nèi)皮細胞增加分泌NO、增加NOS活力，甲羥戊酸能減弱以上作用。 3．缺氧及復(fù)氧均使eNOSmRNA減少；缺氧使iNOSmRNA減少，但復(fù)氧使之增加；缺氧及復(fù)氧均使eN0S蛋白表達減少，辛伐他汀可