SHH、E-cadherin和IL-6在慢性結(jié)石性膽囊炎組織中的表達(dá)及其意義.pdf

1、背景和目的:
　　 Sonic Hedgehog(SHH)分泌信號(hào)分子家族在早期胚胎發(fā)育、器官分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，通路的異常激活還與人類腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)密切相關(guān)。SHH蛋白是由SHH基因編碼的一種高度保守的分泌型糖蛋白。上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)是一類廣泛分布于胚胎和成熟組織上皮組織介導(dǎo)細(xì)胞間同質(zhì)粘附的鈣依賴性單次跨膜糖蛋白，是在生理?xiàng)l件下維持組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的完整性和細(xì)胞極性的重要成分。白細(xì)胞介素-6（int

2、erleukin-6）是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中重要成分之一，亦是一種多功能的細(xì)胞因子，通過復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化及免疫反應(yīng)等過程都具有重要的調(diào)節(jié)作用。最近越來越多的研究顯示，SHH信號(hào)通路的異常激活和過度表達(dá)、E-cadherin表達(dá)減弱或缺失及IL-6的失調(diào)控參與多種腫瘤的發(fā)生過程，但SHH信號(hào)通路、E-cadherin和IL-6在炎癥疾病尤其是結(jié)石性膽囊炎組織中的作用在國(guó)內(nèi)尚無報(bào)道。本課題擬通過對(duì)慢性結(jié)石性膽囊

3、炎、膽囊癌組織標(biāo)本中SHH、E-cadherin和IL-6表達(dá)水平的同步觀察，探討慢性結(jié)石性膽囊炎向膽囊癌發(fā)展轉(zhuǎn)化機(jī)制，目的旨在尋找膽囊癌特異性分子標(biāo)志物，以利早期診斷及特異性靶向治療。
　　 材料和方法:
　　 1.膽囊炎標(biāo)本的收集:選取廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院2005年1月至2010年12月間經(jīng)病理確診、且術(shù)后病理蠟塊保存完好的慢性結(jié)石性膽囊炎患者術(shù)后的組織標(biāo)本120例，其中男性48例，女性72例，平均年齡51.8歲。其中

4、輕度慢性結(jié)石性膽囊炎45例，中度慢性結(jié)石性膽囊炎45例，重度慢性結(jié)石性膽囊炎30例。對(duì)照組為囊腺癌患者術(shù)后組織標(biāo)本（36例），男性20例，女性16例，平均年齡61.4歲，手術(shù)前均未放療或化療。
　　 2.常規(guī)HE染色判斷膽囊炎分級(jí):60℃烤片30min，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水;磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5min，共3次;蘇木素染色液染色5min;自來水沖洗去多余的染色液，約10min，蒸餾水洗滌;鹽酸酒精分化30s;自來水沖洗，

5、浸泡15min;伊紅染色液染色30s-2min（根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整時(shí)間）;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。慢性結(jié)石性膽囊炎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):輕度:病程＜1年;B超提示膽囊壁輕度肥厚或無明顯的結(jié)節(jié)狀增厚現(xiàn)象;病理檢查顯示黏膜上皮保持完好.腺上皮細(xì)胞無異型性，炎細(xì)胞浸潤(rùn)以淋巴細(xì)胞為主，有或無羅-阿氏竇下延，有腺體的輕度增生，黏液腺分泌增強(qiáng)。中度:介于輕度和重度之間。重度:病程＞5年;B超檢查提示有膽囊體積的萎縮或增大，有膽囊壁彌漫性或局

6、限性（結(jié)節(jié)狀）增厚，多伴有息肉樣病變;病理檢查顯示黏膜上皮部分或大部分脫失，未脫失的腺上皮細(xì)胞形成代償性區(qū)域性增生集中，增生的腺體有不規(guī)則的擴(kuò)張，腺上皮細(xì)胞增生活躍。增厚的膽囊壁組織內(nèi)形成單個(gè)腺管及多個(gè)腺管的異型增生灶，炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度重，淋巴濾泡形成，纖維結(jié)締組織增生，多有羅-阿氏竇下延，黏液腺分泌增強(qiáng)。
　　 3.免疫組化法檢測(cè)組織標(biāo)本SHH、IL-6和E-cadherin蛋白表達(dá):60℃烤片30min，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫

7、水后，對(duì)組織抗原進(jìn)行高溫?zé)嵝迯?fù);室溫下冷卻至常溫:磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5min，共3次，加3％過氧化氫孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性;磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2min，共3次;滴加非免疫性動(dòng)物血清阻斷非特異性結(jié)合，20min后甩去封閉液加一抗4℃保濕，過夜;PBS洗5min，共3次，滴加二抗，室溫孵育30min; PBS洗2min，共3次;DAB顯色，自來水終止反應(yīng)并沖洗5min;蘇木素復(fù)染，清水沖洗;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性

8、樹膠封片。
　　 4.病理圖像分析定量檢測(cè)組織標(biāo)本SHH、IL-6和E-cadherin蛋白含量:切片經(jīng)免疫組化染色完成后，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同高倍視野(×400)進(jìn)行拍照。免疫組織化學(xué)染色圖像分析檢測(cè):在光鏡下觀察指標(biāo):免疫復(fù)合物沉積部位及免疫反應(yīng)強(qiáng)度的觀察。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)細(xì)胞膜和（或）胞漿出現(xiàn)棕黃色陽性物質(zhì)作為陽性細(xì)胞。觀察參數(shù):慢性結(jié)石性膽囊炎和膽囊癌組織中E-cadherin和IL-6表達(dá)的陽性顆粒的參數(shù)值——平均

9、灰度、陽性單位。圖像分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:在400倍視野下，每張玻片選取5個(gè)視野，采用武漢千屏公司HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖片報(bào)告分析系統(tǒng)測(cè)定陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。膽囊炎、膽囊癌組織SHH、IL-6、E-cad蛋白表達(dá)的陽性單位、平均灰度值以x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行了完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析（方差齊時(shí)采用Fisher法，其中兩兩比較采用L

10、SD法;方差不齊時(shí)采用Welch法，其中兩兩比較采用Dunnett T3法）及Pearson相關(guān)分析，以F為統(tǒng)計(jì)量，以雙側(cè)a=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.SHH的表達(dá)與各臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系:SHH主要在膽囊黏膜上皮細(xì)胞和膽囊癌細(xì)胞的胞膜上和胞漿內(nèi)表達(dá)。慢性輕、中、重度結(jié)石性膽囊炎及對(duì)照組（膽囊癌組）組織標(biāo)本中SHH陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

11、01)，表現(xiàn)出隨慢性結(jié)石性膽囊炎由輕到重的不同病理損傷程度而陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值呈顯著性上升趨勢(shì)，對(duì)照組（膽囊癌組）最高。SHH蛋白表達(dá)與性別、年齡等因素均無關(guān)(P＞0.05)，SHH蛋白表達(dá)與結(jié)石大小(直徑＞3cm或≤3cm)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.E-cadherin的表達(dá)與各臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系:E-cadherin主要在膽囊黏膜上皮細(xì)胞和膽囊癌細(xì)胞的胞膜上和胞漿內(nèi)表達(dá)。慢性輕、中、重度結(jié)石

12、性膽囊炎及對(duì)照組（膽囊癌組）組織標(biāo)本中E-cadherin陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表現(xiàn)出隨慢性結(jié)石性膽囊炎由輕到重的嚴(yán)重程度而陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值呈顯著性下降趨勢(shì)，對(duì)照組（膽囊癌組）最低。E-cadherin蛋白表達(dá)與性別、年齡等因素均無關(guān)（P＞0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)與結(jié)石大小(直徑＞3cm或≤3cm)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.IL-6的表達(dá)與各臨

13、床病理指標(biāo)之間的關(guān)系:IL-6主要在膽囊黏膜上皮下間質(zhì)、膽囊黏膜上皮細(xì)胞胞漿和膽囊癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)（圖4）。慢性輕、中、重度結(jié)石性膽囊炎及對(duì)照組（膽囊癌組）組織標(biāo)本中IL-6陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表現(xiàn)出隨慢性結(jié)石性膽囊炎由輕到重的不同病理損傷程度而陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值呈顯著性上升趨勢(shì)，對(duì)照組（膽囊癌組）最高（表1）。IL-6表達(dá)與性別、年齡等因素均無關(guān)(P＞0.05)，IL-6表達(dá)與結(jié)石

14、大?。ㄖ睆剑?cm或≤3cm）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.SHH、E-cadherin和IL-6蛋白在慢性結(jié)石性膽囊炎組織中表達(dá)的相關(guān)性分析:配對(duì)資料的Pearson相關(guān)分析顯示，SHH表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r平均灰度=-0.71，r陽性單位=-0.68，P＜0.01），SHH表達(dá)隨E-cadherin表達(dá)上升而表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。IL-6表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r平均灰度=

15、-0.75，r陽性單位=-0.83，P＜0.01），IL-6表達(dá)隨E-cadherin表達(dá)上升而表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。SHH表達(dá)與IL-6表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r平均灰度=0.71，r陽性單位=0.88，P＜0.01），SHH表達(dá)隨IL-6表達(dá)上升亦表現(xiàn)出上升趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SHH、E-cadherin和IL-6表達(dá)與慢性結(jié)石性膽囊炎病情的嚴(yán)重程度及膽囊結(jié)石的大小有關(guān)，與病人年齡、性別等因素均無關(guān)。研究通

16、過Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，SHH和IL-6表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，SHH、IL-6與E-cadherin表達(dá)分別呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。我們的結(jié)果提示，在慢性結(jié)石性膽囊炎組織中，SHH信號(hào)通路異常激活可能引起膽囊上皮細(xì)胞的過度增殖和惡變，E-cadherin作為一種抑癌基因，其表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致膽囊上皮細(xì)胞骨架破壞與極性喪失，IL-6的長(zhǎng)期表達(dá)上調(diào)可能引起膽囊上皮細(xì)胞的過度增殖，并且三者存在一定相關(guān)性。有研究表明，E-cadherin表達(dá)下調(diào)參與激

17、活SHH信號(hào)通路，SHH通路中轉(zhuǎn)錄因子Glil能活化E-cadherin的抑制物Snail，現(xiàn)已明確Snail作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，可直接與E-cadherin的啟動(dòng)子E-boxes結(jié)合，從而抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)進(jìn)而介導(dǎo)上皮細(xì)胞骨架破壞、轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強(qiáng)。組織炎癥反應(yīng)過程中，表達(dá)上調(diào)的IL-6可激活核轉(zhuǎn)錄因子KB(NF-KB)，而活化的NFKB可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)引起轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)上調(diào)以介導(dǎo)上皮

18、細(xì)胞骨架破壞。因此我們推測(cè)，作為誘發(fā)慢性膽囊炎最主要原因之一的膽囊結(jié)石長(zhǎng)期機(jī)械損傷導(dǎo)致膽囊黏膜上皮細(xì)胞骨架破壞，極性喪失和E-cadherin表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而通過激活SHH信號(hào)通路引起膽囊上皮細(xì)胞過度增殖，同時(shí)活化的SHH通路通過活化Snail進(jìn)而抑制E-cadherin的表達(dá)。慢性炎癥導(dǎo)致細(xì)胞因子IL-6過表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)膽囊黏膜上皮細(xì)胞過度增殖。IL-6亦通過激活NF-KB誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)下調(diào)，使上皮細(xì)胞骨架破壞、極性喪失進(jìn)