豬帶絳蟲重要疫苗候選分子及其免疫保護(hù)性研究.pdf

1、囊尾蚴病(Cysticereosis)是由豬帶絳蟲(Taenia solium)的中絳期幼蟲-豬囊尾蚴寄生于人或豬等中間宿主而引起的人畜共患寄生蟲病。該病呈全球性分布,主要流行于經(jīng)濟(jì)發(fā)展相對滯后的地區(qū),引發(fā)不同程度的公共衛(wèi)生問題,危害人體健康,障礙養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,因而成為公認(rèn)的社會政治經(jīng)濟(jì)病。我國對豬囊尾蚴病的防控以往主要依靠藥物驅(qū)蟲治療和加強(qiáng)公共衛(wèi)生管理。但囊尾蚴病在部分地區(qū)不僅沒有得到有效的遏制,反而有上升趨勢。對豬囊尾蚴病高劑量的藥

2、物治療雖然有效,但會造成藥物在肉品中的殘留,無助于改善肉品質(zhì)量。基于我國的國情和人文環(huán)境,若想更有效的控制人、豬囊尾蚴病,必須尋求以免疫預(yù)防為主的綜合防控措施。常規(guī)技術(shù)研制的疫苗雖然有效,但抗原來源受到限制,不可能規(guī)?；a(chǎn)。只有利用基因工程技術(shù)開發(fā)新型疫苗,才有可能使囊尾蚴病的免疫預(yù)防成為現(xiàn)實。本研究利用RT-PCR等方法從孵化激活的豬帶絳蟲六鉤蚴與囊尾蚴中克隆了45W基因家族、TSOL18基因和B抗原基因,采用生物信息學(xué)的方法分析了

3、部分基因的結(jié)構(gòu)特征及其編碼蛋白的特性,在此基礎(chǔ)上選擇原核和真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了高效表達(dá),評價了三種抗原的免疫原性。 1.利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從激活的豬帶絳蟲六鉤蚴克隆到45W基因家族。測序及DNAstar軟件分析證實,得到八個A型轉(zhuǎn)錄本、三個相應(yīng)的B型轉(zhuǎn)錄本和四個其它B型轉(zhuǎn)錄本,以及一個C型轉(zhuǎn)錄本,推測45W基因家族至少有12個成員,而不是如國外學(xué)者所認(rèn)為的4個。豬帶絳蟲45W A3和B2蛋白可能是跨膜糖蛋白,

4、跨膜區(qū)位于C末端,在它的結(jié)構(gòu)中可能還存在FnⅢ組件。45W蛋白可能有磷酸化修飾的加工過程。由此推測,45W基因家族成員可能有調(diào)節(jié)基因的表達(dá)、維持正常的細(xì)胞形態(tài)等多種功能,并且不一定所有的45W相關(guān)蛋白都參與機(jī)體的免疫應(yīng)答過程。構(gòu)建了表達(dá)載體pGEX-4BX,在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物為分子量40ku的GST-4BX融合蛋白,其中45W-4BX的分子量為12ku,與推測的分子量大小一致。在37℃、1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

5、條件下,目的蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白量的35％,主要以可溶性形式存在,也有一定量的包涵體。免疫印跡結(jié)果表明,45W-4BX表達(dá)產(chǎn)物與人囊蟲病患者血清強(qiáng)烈反應(yīng),具有很好的反應(yīng)原性。表達(dá)蛋白經(jīng)GST Sepharose親和層析柱純化后,制備重組抗原疫苗進(jìn)行豬免疫保護(hù)性研究。實驗分五組：第一組為非免疫感染對照組；第二組為GST+206佐劑對照組；第三組為45W-4BX+206佐劑組；第四組為45W-4BX/pcDNA3-IL4組；第五組為囊尾蚴

6、粗制抗原+206佐劑組。其中,粗制抗原的免疫劑量為1.2mg/頭份；45W-4BX抗原的免疫劑量為0.3mg/頭份；pcDNA3-IL4的劑量為200μg/頭份；第二～五組在第一次免疫后21d進(jìn)行二免,二免后一周對全部實驗豬進(jìn)行攻擊感染,每頭豬25000枚蟲卵.結(jié)果表明,與非免疫感染對照組相比,GST對照組的減蟲率為零,粗制抗原疫苗免疫組減蟲率為92％,45W-4BX重組抗原疫苗免疫組減蟲率為94％,45W-4BX/pcDNA3-IL4

7、重組抗原疫苗組減蟲率為97.5％。顯示pcDNA3-IL4具有一定的免疫增強(qiáng)作用。 2.通過RT-PCR從孵化和激活的六鈞蚴中獲得TSOL18基因,測序結(jié)果與已報道的豬帶絳蟲美洲株TSOL18的同源性為99.5％,氨基酸的同源性為98.5％,兩者間僅有2個堿基和氨基酸的差異,說明TSOL18基因在不同種株間相對保守。構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPIC9K-TSOL18,在畢赤酵母中以分泌的方式表達(dá)豬帶絳蟲TSOL18基因,利用SDS-P

8、AGE、Western blot和糖苷內(nèi)切酶H(Endo-H)分析目的蛋白的表達(dá)水平、特征及其生物活性。結(jié)果表明：誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)上清中具有反應(yīng)活性的重組蛋白,大小為12ku和16ku(糖基化蛋白),占培養(yǎng)上清蛋白總量的80％以上；在5升生物反應(yīng)器中,通過優(yōu)化表達(dá)條件,重組蛋白的表達(dá)量高達(dá)2.54g/L;目的蛋白進(jìn)行了適度的糖基化修飾,與理論分析相符。以pcDNA3-IFN-γ、pcDNA3-IL4和pUC18-CpG作為分子免疫增強(qiáng)劑、

9、以206為佐劑分別制備了TSOL18重組抗原疫苗,進(jìn)行豬體免疫原性評價,共進(jìn)行兩個實驗。實驗一,有六個處理:A.非免疫感染對照組；B.粗抗原+206免疫對照組；C.TSOL18重組抗原+206佐劑組；D.TSOL18重組抗原+206佐劑+pcDNA3-IFN-γ組:E.TSOL18重組抗原+206佐劑+pcDNA3-IL4組；F.TSOL18重組抗原+206佐劑+pcDNA3-CpG組。實驗二,有三個處理:A.非免疫感染對照組；B.粗抗

10、原+206佐劑免疫組；C.TSOL18重組抗原+206佐劑組。實驗二中重組抗原的免疫劑量由實驗一的200μg/頭份提高到400μg/頭份。實驗結(jié)果表明：在實驗一中,pcDNA3-IL4和pUC18-CpG作為免疫增強(qiáng)劑,雖然明顯增強(qiáng)了免疫動物的抗體水平,但沒有明顯增強(qiáng)免疫保護(hù)作用,兩組減蟲率分別為68.7％和67％,而以pcDNA3-IFN-γ 作為免疫增強(qiáng)劑的實驗組中,雖然豬的抗體水平?jīng)]有明顯升高,但淋巴細(xì)胞的增殖較免疫前提高

11、了近1.7倍,疫苗組的減蟲率達(dá)到了91％,在抗原劑量僅為常規(guī)疫苗1/6的情況下,免疫效果與常規(guī)疫苗組相當(dāng)。在實驗二中,粗抗原+206佐劑組的減蟲率為89％,TSOL18重組抗原+206佐劑組的減蟲率為94％。上述結(jié)果提示,IFN-γ有可能成為豬帶絳蟲TSOL18重組疫苗良好的分子免疫佐劑；畢赤酵母表達(dá)的豬帶絳蟲TSOL18抗原具有與天然蛋白近似的免疫原性,可誘導(dǎo)高水平的免疫應(yīng)答。 3.從豬帶絳蟲囊尾蚴中提取總RNA,利用RT-P

12、CR及重疊延伸PCR法,擴(kuò)增到2.6kb的AgB基因完整序列,測序證明所克隆的AgB基因的核苷酸序列與同源參考序列的同源性為99.7％。將AgB基因亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE檢測,表達(dá)產(chǎn)物為121ku的GST-AgB融合蛋白,其中AgB蛋白的分子量為95ku,與報道的蛋白大小相符。目的蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達(dá),表達(dá)量占菌體總蛋白的28％,表達(dá)產(chǎn)物能被豬囊蟲陽性血清所識別。

13、通過對包涵體的洗滌、純化及變復(fù)性等處理獲得了蛋白濃度為3mg/mL、純度>90％的純化目的蛋白。用純化的重組AgB按50μg/只、間隔兩周、三次免疫8只小鼠,同時設(shè)陰性和豬囊尾蚴粗抗原作為對照,最后一次免疫后一周采血分離血清,用重組抗原作為包被抗原檢測了27份豬囊尾蚴陽性血清,符合率為100％,8份健康豬血清均為陰性。將AgB基因克隆至pcDNA3.1,構(gòu)建了pcDNA3-B DNA疫苗,進(jìn)行豬體免疫原性評價。實驗共有4個處理：非免疫感

14、染對照組；pcDiNA3-B 200μg組；pcDNA3-B1000μg組。一免后三周進(jìn)行二免,二免后9d,按每頭豬20000枚蟲卵進(jìn)行攻擊感染,90d后剖檢。結(jié)果表明,與非免疫對照組相比,豬囊尾蚴粗抗原組的減蟲率為91.8％,pcDNA3-B 200μg的減蟲率為36.6％,pcDNA3-B 1000μg組的減蟲率為92.6％,實驗豬的4/5頭沒有檢出具有活力的豬囊尾蚴。這些結(jié)果為今后利用AgB基因開發(fā)核酸疫苗提供了依據(jù)。 綜

15、上所述,本研究主要結(jié)果如下：①對豬帶絳蟲45W基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)、深入的比較研究,證實該基因家族至少有12個成員,而非先前認(rèn)為的4個；②對45W-4B、TSOL18和AgB進(jìn)行了修飾或表達(dá)條件優(yōu)化,實現(xiàn)了外源基因在大腸桿菌和酵母中的高效表達(dá),為抗原蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；③證明六鈞蚴階段45W和TSOL18重組抗原作為亞單位疫苗其免疫原性優(yōu)于常規(guī)囊尾蚴粗抗原；④構(gòu)建的AgB核酸疫苗不僅具有良好的免疫預(yù)防效果,而且有治療囊尾蚴病的潛力