Tca4和Zorro2的轉(zhuǎn)座激活與白念珠菌適應(yīng)性形成的相關(guān)性研究.pdf

1、本課題研究發(fā)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tca4和Zorro2的轉(zhuǎn)座激活與白念珠菌適應(yīng)性形成之間存在緊密的聯(lián)系。本研究成功的采用不同溫度培養(yǎng)誘導(dǎo)白念珠菌，篩選出了高溫(37℃)時(shí)對藥物敏感性有所改變的子代。用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測白念珠菌敏感株ATCC10231及其溫度長期誘導(dǎo)后對氟康唑更加敏感的菌株AT-37-44中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tca4中兩個(gè)開放閱讀框Orf19.2668和Orf19.2669的表達(dá)水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)高溫長期誘導(dǎo)菌株AT-37-4

2、4中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tca4中的兩個(gè)具有編碼蛋白功能的開放閱讀框的mRNA表達(dá)水平相對于ATCC10231有明顯的升高。我們進(jìn)一步采用Spot assay和生長曲線實(shí)驗(yàn)考查菌株對藥物刺激的適應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)高溫誘導(dǎo)菌株的適應(yīng)性減弱。這些結(jié)果提示我們，白念珠菌在高溫刺激的條件下可能通過激活反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子來調(diào)控自身的適應(yīng)性。
　　 本課題組成員前期用咪康唑長期誘導(dǎo)白念珠菌SC5314，獲得菌株SC-m1、Sc-m2以及SC-m3，我們在前期研

3、究結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討咪康唑誘導(dǎo)白念珠菌Zorro2的轉(zhuǎn)座激活與適應(yīng)性的相關(guān)性。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測白念珠菌敏感株SC5314及其咪康唑長期誘導(dǎo)形成耐藥的菌株SC-m1、SC-m2、SC-m3中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Zorro2及其兩個(gè)編碼蛋白的開放閱讀框Orf19.7274和Orf19.7275的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)咪康唑長期誘導(dǎo)菌株SC-m1、SC-m2、SC-m3中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Zorro2及其兩個(gè)具有編碼蛋白功能的開放閱讀框的mR

4、NA表達(dá)水平相對于SC5314有明顯的升高。我們利用Southern blotting雜交實(shí)驗(yàn)檢測咪康唑刺激白念珠菌Zorro2轉(zhuǎn)座激活并引起耐藥菌株與其親本野生菌的基因組差異，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的條帶增多，轉(zhuǎn)座子的條帶位置也有所改變，證明Zorro2確實(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)座。
　　 第三部分是在第二部分的基礎(chǔ)上研究Zorro2的轉(zhuǎn)座激活對菌株適應(yīng)性的影響。通過微量液基稀釋法、菌斑分析法（Spot assay實(shí)驗(yàn)）、生長曲線實(shí)驗(yàn)、小鼠體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)

5、等方法，考察咪康唑長期刺激致Zorro2轉(zhuǎn)座激活的白念珠菌與親本菌相比，在對不同藥物的耐藥性，以及對動物的致病力等方面的差異。研究結(jié)果表明，咪康唑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座激活的菌與親本菌相比，對唑類藥物、氧化應(yīng)激、蛋白抑制劑等敏感性較弱，我們還通過小鼠體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)考察了不同菌株對白念珠菌小鼠的感染情況，觀察小鼠存活時(shí)間。結(jié)果顯示:尾靜脈注射感染咪康唑誘導(dǎo)菌株SC-m1、SC-m2和SC-m3組的存活時(shí)間比親本菌組顯著延長?？梢?，在本實(shí)驗(yàn)中菌株的耐藥性增

6、強(qiáng)反而使其毒力減弱。
　　 最后一部分是對白念珠菌適應(yīng)性形成及Zorro2轉(zhuǎn)座激活的機(jī)制探討。為了考察咪康唑誘導(dǎo)菌株對藥物的外轉(zhuǎn)運(yùn)能力我們用羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)考察了不同菌株對羅丹明6G的外排能力，發(fā)現(xiàn)咪康唑誘導(dǎo)菌株對羅丹明6G的外排能力明顯增強(qiáng)。但是可促進(jìn)羅丹明6G外排的耐藥相關(guān)基因CDR1、MDR1，及其常見耐藥相關(guān)基因的表達(dá)普遍下調(diào)。為了探討SC-m1、SC-m2和SC-m3耐藥性增強(qiáng)，而毒力減弱的可能機(jī)制，我們還觀察了與耐

7、藥及毒力相關(guān)的菌絲的形成能力。發(fā)現(xiàn)耐藥菌的菌絲形成能力與親本菌相比明顯降低，大部分是以酵母態(tài)形式存在的。磷脂酶是與毒力相關(guān)的一種酶，通過磷脂酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，耐藥性強(qiáng)的菌株比親本菌的磷脂酶活性顯著降低(p＜0.05)，表明咪康唑誘導(dǎo)菌株的磷脂酶活性降低。為了驗(yàn)證菌株敏感性與Zorro2表達(dá)水平的相關(guān)性，我們分別檢測了從51株臨床分離白念珠菌對氟康唑的敏感性，并分別提取其總mRNA，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測其Zorro2 RNA的含

8、量，比較菌株敏感性與Zorro2表達(dá)RNA表達(dá)水平的相關(guān)性，更加證實(shí)了實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象與Zorro2中的開放閱讀框Orf19.7274的RNA高表達(dá)密切相關(guān)，與Orf19.7275的高表達(dá)也有一定關(guān)系，雖然Zorro2的RNA表達(dá)量在耐藥菌中和敏感菌中沒有顯著性差異，但在耐藥菌中的表達(dá)還是明顯也是高于敏感菌，高表達(dá)發(fā)生率為48.14％，而敏感菌中僅為32％。因?yàn)榕R床上白念珠菌耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是多種作用機(jī)理共同作用導(dǎo)致的，其作用機(jī)制