白念珠菌二相性的SAP2和PLB1基因的初步研究.pdf

1、目的：通過對(duì)編碼白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶2(Sap2)的SAP2基因和編碼白念珠菌磷脂酶B1（Plb1）的PLB1基因分別在該菌孢子相和菌絲相的mRNA水平和DNA水平的比較，從分子生物學(xué)水平探討編碼白念珠菌侵襲性酶的兩個(gè)重要毒力基因在白念珠菌二相性中轉(zhuǎn)錄水平及DNA水平的差異，為進(jìn)一步研究白念珠菌的遺傳變異、致病性與防治提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1.分別采用YPD培養(yǎng)基和含20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)

2、白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC-10231的孢子相細(xì)胞和菌絲相細(xì)胞；2.采用RNAiso Plus試劑聯(lián)合玻璃珠破壁方法，分別提取白念珠菌的孢子相和菌絲相細(xì)胞的總 RNA；3.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）技術(shù)和凝膠分析軟件bandscan4.3，分別比較SAP2基因及PLB1基因在白念珠菌孢子相和菌絲相細(xì)胞中其mRNA水平的表達(dá)差異；4.

3、采用提取真菌細(xì)胞DNA的試劑盒，分別提取白念珠菌的孢子相與菌絲相細(xì)胞的總DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技術(shù)，分別比較SAP2基因及PLB1基因在白念珠菌孢子相與菌絲相中其DNA水平的差異。
　　結(jié)果：1.成功培養(yǎng)出白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC-10231孢子相和菌絲相細(xì)胞，孢

4、子相細(xì)胞的純度達(dá)100%，菌絲相細(xì)胞純度在95%以上；2.提取的白念珠菌孢子相細(xì)胞總RNA純度為1.897±0.047，濃度為1.121±0.175（μg/μl）；菌絲相細(xì)胞總RNA純度為1.874±0.064，濃度為0.523±0.031（μg/μl）。提取的孢子相及菌絲相細(xì)胞總RNA電泳結(jié)果均可見較為清晰的28S、18S、5S三條帶，說明提取的白念珠菌二相細(xì)胞的RNA完整性均較好；3.運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)和凝膠分析軟件band

5、scan4.3，得出SAP2基因在孢子相和菌絲相細(xì)胞內(nèi)mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.789±0.039，0.927±0.062；PLB1基因在孢子相和菌絲相細(xì)胞內(nèi)mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.899±0.035，0.998±0.012；通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，得出SAP2、PLB1基因在白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC-10231孢子相與菌絲相細(xì)胞中其mRNA的相對(duì)表達(dá)量均有差異，且這兩個(gè)基因在菌絲相細(xì)胞中其mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于孢子相（P

6、均<0.01）；4.成功提取白念珠菌孢子相和菌絲相細(xì)胞總 DNA，應(yīng)用 PCR-SSCP技術(shù)，得到的SSCP圖譜顯示：白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC-10231孢子相及菌絲相細(xì)胞SAP2基因的電泳帶型有差異，而PLB1基因在二相中的電泳帶型無明顯差異。
　　結(jié)論：1.采用 YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC-10231，可得到完全純度的孢子相細(xì)胞，采用含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC-10231，可誘

7、導(dǎo)培養(yǎng)出純度極高的菌絲相細(xì)胞；2.采用RNAiso Plus試劑聯(lián)合玻璃珠破壁方法提取的白念珠菌孢子相和菌絲相細(xì)胞總RNA的濃度和純度較高、完整性好，可以滿足后續(xù)分子生物學(xué)的研究需要；3. SAP2基因以及PLB1基因在白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC-10231孢子相和菌絲相中其mRNA相對(duì)表達(dá)量有差異，其菌絲相mRNA表達(dá)水平均高于孢子相；4．采用提取真菌細(xì)胞 DNA的試劑盒，可提取到白念珠菌孢子相和菌絲相細(xì)胞總 DNA，應(yīng)用PCR-SSCP