白念珠菌二相性的SAP2和PLB1基因的初步研究.pdf

1、目的：通過對編碼白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶2(Sap2)的SAP2基因和編碼白念珠菌磷脂酶B1（Plb1）的PLB1基因分別在該菌孢子相和菌絲相的mRNA水平和DNA水平的比較，從分子生物學水平探討編碼白念珠菌侵襲性酶的兩個重要毒力基因在白念珠菌二相性中轉(zhuǎn)錄水平及DNA水平的差異，為進一步研究白念珠菌的遺傳變異、致病性與防治提供初步實驗依據(jù)。
　　方法：1.分別采用YPD培養(yǎng)基和含20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)

2、白念珠菌標準株ATCC-10231的孢子相細胞和菌絲相細胞；2.采用RNAiso Plus試劑聯(lián)合玻璃珠破壁方法，分別提取白念珠菌的孢子相和菌絲相細胞的總 RNA；3.應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）技術(shù)和凝膠分析軟件bandscan4.3，分別比較SAP2基因及PLB1基因在白念珠菌孢子相和菌絲相細胞中其mRNA水平的表達差異；4.

3、采用提取真菌細胞DNA的試劑盒，分別提取白念珠菌的孢子相與菌絲相細胞的總DNA，應用聚合酶鏈式反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技術(shù)，分別比較SAP2基因及PLB1基因在白念珠菌孢子相與菌絲相中其DNA水平的差異。
　　結(jié)果：1.成功培養(yǎng)出白念珠菌標準株ATCC-10231孢子相和菌絲相細胞，孢

4、子相細胞的純度達100%，菌絲相細胞純度在95%以上；2.提取的白念珠菌孢子相細胞總RNA純度為1.897±0.047，濃度為1.121±0.175（μg/μl）；菌絲相細胞總RNA純度為1.874±0.064，濃度為0.523±0.031（μg/μl）。提取的孢子相及菌絲相細胞總RNA電泳結(jié)果均可見較為清晰的28S、18S、5S三條帶，說明提取的白念珠菌二相細胞的RNA完整性均較好；3.運用半定量RT-PCR技術(shù)和凝膠分析軟件band

5、scan4.3，得出SAP2基因在孢子相和菌絲相細胞內(nèi)mRNA的相對表達量分別為0.789±0.039，0.927±0.062；PLB1基因在孢子相和菌絲相細胞內(nèi)mRNA的相對表達量分別為0.899±0.035，0.998±0.012；通過對數(shù)據(jù)進行配對t檢驗，得出SAP2、PLB1基因在白念珠菌標準株ATCC-10231孢子相與菌絲相細胞中其mRNA的相對表達量均有差異，且這兩個基因在菌絲相細胞中其mRNA的相對表達量均高于孢子相（P

6、均<0.01）；4.成功提取白念珠菌孢子相和菌絲相細胞總 DNA，應用 PCR-SSCP技術(shù)，得到的SSCP圖譜顯示：白念珠菌標準株ATCC-10231孢子相及菌絲相細胞SAP2基因的電泳帶型有差異，而PLB1基因在二相中的電泳帶型無明顯差異。
　　結(jié)論：1.采用 YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)白念珠菌標準株ATCC-10231，可得到完全純度的孢子相細胞，采用含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)白念珠菌標準株ATCC-10231，可誘

7、導培養(yǎng)出純度極高的菌絲相細胞；2.采用RNAiso Plus試劑聯(lián)合玻璃珠破壁方法提取的白念珠菌孢子相和菌絲相細胞總RNA的濃度和純度較高、完整性好，可以滿足后續(xù)分子生物學的研究需要；3. SAP2基因以及PLB1基因在白念珠菌標準株ATCC-10231孢子相和菌絲相中其mRNA相對表達量有差異，其菌絲相mRNA表達水平均高于孢子相；4．采用提取真菌細胞 DNA的試劑盒，可提取到白念珠菌孢子相和菌絲相細胞總 DNA，應用PCR-SSCP