力學(xué)環(huán)境下天然骨組織體外三維培養(yǎng)的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　用骨組織工程技術(shù)構(gòu)建的人工骨在臨床治療中能對骨折和骨損傷病人能夠起到修復(fù)和置換的作用,使其在體內(nèi)能夠部分或短期地代替患者原有骨的功能、維持基本的骨形態(tài),然而,這種有生命的人工骨的生物活性、與機體天然骨的相容性、排異反應(yīng)等諸多問題一直都沒有解決,影響著人工骨研究的發(fā)展進程。因此,有必要首先對機體內(nèi)的天然骨的結(jié)構(gòu)、組成及其生長環(huán)境進行充分研究,利用天然骨的構(gòu)成及生長的相關(guān)研究成果來開展骨組織工程的研究將會更有目的

2、性和導(dǎo)向性。目前國內(nèi)外就此方面的研究一致認為,骨是一種有生命的生物材料,又是能進行新陳代謝且具有重建行為的生物組織。這種活性組織在體內(nèi)的生長和構(gòu)建受力學(xué)因素作用明顯。早在19世紀,Juliswolff就提出外部應(yīng)力能影響骨的形狀與結(jié)構(gòu);越來越多的研究也顯示,骨組織的形狀、骨量及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化取決于骨所處的應(yīng)力環(huán)境的改變,在外來應(yīng)力刺激下,其能自動地進行骨組織的聚集與吸收,形成完美的自控反饋系統(tǒng),而其他的非生物力學(xué)因素則起輔助調(diào)控作用。

3、然而,在機體內(nèi)部對骨的力學(xué)環(huán)境研究受其它因素影響較多,因此,若能在體外制備骨生長的模型,并建立有效的力學(xué)培養(yǎng)環(huán)境,將有利于開展骨的生物力學(xué)研究;但至今,這方面的研究工作并不多見,而且難度也非常大。本項目以來自兔股骨頭松質(zhì)骨制備的骨組織體外模型進行體外力學(xué)刺激實驗,目的是探討在體外培養(yǎng)環(huán)境下,力學(xué)刺激對三維培養(yǎng)的骨組織及其內(nèi)部相關(guān)骨細胞生長的影響,以便在組織層面對應(yīng)力環(huán)境與骨生長的關(guān)系進行研究。
　　研究方法:
　　1.摘取3

4、月齡新西蘭大白兔的股骨,無菌處理后將股骨頭的松質(zhì)骨部分制備成直徑為8mm,厚度為3mm的質(zhì)骨體外培養(yǎng)模型;
　　2.將制備好的松質(zhì)骨體外培養(yǎng)模型放入含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,用本室設(shè)計的力學(xué)負載和循環(huán)灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)進行培養(yǎng),分別在培養(yǎng)3d、5d和7d后對其進行HE染色和電鏡掃描,并和未培養(yǎng)的骨組織模型進行比較,評價模型在體外生長情況;
　　3.利用Micro-CT對骨組織模型進行掃描及用Mimics、Gemag

5、ic等軟件進行模型的3D重建,并用有限元分析軟件分析表觀應(yīng)力1000με、2000με和3000με對模型內(nèi)部的影響作用;然后結(jié)合骨組織在體內(nèi)的生理應(yīng)力作用情況及本課題組的前期研究結(jié)果,用動態(tài)負載和灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的松質(zhì)骨模型實施了1000με、2000με、3000με和4000με,頻率為1Hz的表觀應(yīng)力刺激;
　　4.分別在表觀應(yīng)力刺激5d和14d后,檢測不同強度刺激組的堿性磷酸酶(AKP)的活性,并分析不同強度

6、的表觀應(yīng)力刺激對松質(zhì)骨內(nèi)成骨細胞生長的影響作用;
　　5.根據(jù)成骨細胞內(nèi)AKP活性表達情況,分別設(shè)定1000με和2000με表觀應(yīng)力為力學(xué)負載組進行松質(zhì)骨模型體外生長試驗,然后用Instron5865力學(xué)性能測試機對其進行力學(xué)性能檢測;用Micro-CT掃描對其進行骨密度(TMD)檢測;依據(jù)Von-kossa染色試驗和四環(huán)素鈣黃綠素雙標(biāo)記試驗評價力學(xué)刺激對新骨形成的影響;用ELISA、Western blot和qRT-PCR分別

7、檢測Collagen-I、OPG和BMP-2蛋白和基因在不同刺激組的表達變化;
　　6.檢測不同強度力學(xué)刺激對骨組織模型破骨細胞內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性表達的影響;分別在3000με和4000με,頻率為1Hz的表觀應(yīng)力刺激下,用DNALadder試驗檢測骨組織模型細胞內(nèi)DNA的變化,用Caspase活性試劑盒分別檢測Caspase-3/8/9的活性。
　　結(jié)果:
　　1.制備好的松質(zhì)骨體外培養(yǎng)模型經(jīng)過修剪

8、、去脂肪組織后,直徑為8mm,厚度為3mm,大小均勻,表面平整,適合在動態(tài)力學(xué)負載系統(tǒng)上進行力學(xué)環(huán)境下培養(yǎng);
　　2.用力學(xué)負載和循環(huán)灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)培養(yǎng)制備好的松質(zhì)骨體外培養(yǎng)模型能夠保證培養(yǎng)體上下各個面接受到均勻的培養(yǎng)基營養(yǎng)供應(yīng),分別培養(yǎng)3d、5d和7d后經(jīng)過HE染色和掃描電鏡檢測顯示,模型內(nèi)活細胞形態(tài)明顯,且分布密集,在細胞分布和形態(tài)上與未培養(yǎng)組無明顯區(qū)別;
　　3.松質(zhì)骨培養(yǎng)模型經(jīng)Micro-CT掃描后可以看見清晰的

9、組織結(jié)構(gòu),完整密集,而通過對重建的3D模型有限元分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)模型受到3000με的表觀應(yīng)力作用時,模型內(nèi)超過4000με的節(jié)點數(shù)明顯增加(1600個),而低于2000με的表觀應(yīng)力作用時,其內(nèi)部多數(shù)節(jié)點受力保持在3000με以下;
　　4.經(jīng)過5d和14d的表觀應(yīng)力刺激培養(yǎng),骨組織模型的AKP活性表達分別為27.350±0.071(控制組)、26.309±0.034U/gprot、28.121±0.212U/gprot、13.36

10、5±0.105U/gprot、10.161±0.121U/gprot和26.126±0.013U/gprot(控制組)、29.181±0.041U/gprot、33.218±0.034U/gprot、11.151±0.108U/gprot、10.603±0.010U/gprot;分析顯示,AKP活性在表觀應(yīng)力為1000με和2000με間呈遞增趨勢,而在3000με和4000με間呈遞減趨勢;
　　5.在初步檢測骨組織模型AKP活

11、性基礎(chǔ)之上,分別在培養(yǎng)14d和21d后,表觀應(yīng)力為1000με、2000με及未刺激組的其它檢測結(jié)果是:彈性模量和最大受力負荷呈刺激強度和刺激時間遞增,并且與未刺激組相比,2000με能顯著增加模型的彈性模量和最大受力負荷,而1000με刺激時也已使模型的最大負荷發(fā)生顯著變化;骨密度檢測結(jié)果為模型培養(yǎng)21d后,刺激組的TMD都發(fā)生了顯著增加,而培養(yǎng)14d則不能明顯改善其骨密度;Von-kossa染色和鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)記試驗結(jié)果顯示,力學(xué)

12、負載刺激能促進新的類骨質(zhì)形成,并隨著負載強度和培養(yǎng)時間的增加,新生類骨質(zhì)的生成也呈顯著性增加,但Von-kossa染色和鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)記的試驗結(jié)果并未呈等量增加,顯示出兩種方法間又有一定的區(qū)別;分別對Collagen-I、OPG和BMP-2蛋白和基因表達的檢測結(jié)果顯示,三者都隨刺激強度和時間增加呈依賴性,但在蛋白和基因?qū)哟蔚谋磉_規(guī)律又不完全一致;
　　6.分別經(jīng)1000με、2000με、3000με和4000με表觀應(yīng)力刺激5

13、d后,骨組織模型破骨細胞內(nèi)TRAP活性變化結(jié)果分別為19.261±0.103(控制組)、18.911±0.081、18.126±0.134、15.961±0.089和16.023±0.101;而在3000με和4000με刺激下,DNA Ladder結(jié)果顯示,細胞內(nèi)DNA表達為明顯的梯形條帶,呈180-200bp大小;Caspase-3/8/9活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),3000με和4000με表觀應(yīng)力都能顯著增強三者的表達活性。
　　結(jié)

14、論:
　　1.在無菌條件下,采用三月齡新西蘭大白兔股骨頭松質(zhì)骨制備的骨組織體外培養(yǎng)模型,結(jié)構(gòu)和大小能夠保持一致,適于用力學(xué)負載和循環(huán)灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)進行培養(yǎng);
　　2.通過Micro-CT對松質(zhì)骨體外培養(yǎng)模型的掃描可以對其進行3D模型的重建及有限元分析,后者從理論上分析了模型在不同力學(xué)強度刺激作用下,其內(nèi)部的應(yīng)力分布及結(jié)構(gòu)變化,從而為探討該骨組織模型實體在體外合適力學(xué)環(huán)境的培養(yǎng)奠定了理論基礎(chǔ);
　　3.通過對不同表觀

15、應(yīng)力(1000με、2000με、3000με和4000με)刺激作用下骨組織體外培養(yǎng)模型內(nèi)AKP和TRAP的檢測分析,以及一系列的力學(xué)性能、TMD、新骨形成、分子表達和細胞凋亡實驗評價,初步認為體外培養(yǎng)該模型時,低強度(1000με和2000με)力學(xué)刺激可能會促進其內(nèi)部的骨組織生長,并呈劑量和時間的依賴性;相反,高強度(3000με和4000με)的力學(xué)刺激則抑制了其內(nèi)部細胞(Osteoblasts和Osteoclasts)的增殖和