大鼠骺板軟骨細胞體外三維培養(yǎng)及細胞響應(yīng)力學(xué)信號的初步機制.pdf

1、目的：
　　 1.研究大鼠骺板軟骨細胞及前軟骨干細胞（PSCs）接種殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合多孔支架體外三維培養(yǎng)，探討其構(gòu)建組織工程化骺板的可行性。
　　 2.研究動態(tài)壓應(yīng)力對體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細胞外基質(zhì)以及甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）mRNA表達的影響。
　　 3.研究動態(tài)壓應(yīng)力對體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細胞Sox9 mRNA 及蛋白表達水平的影響，并初步探討其力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　 4.研究動態(tài)張

2、應(yīng)力對體外培養(yǎng)的大鼠生長板軟骨細胞甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）表達的影響，并初步探討細胞骨架是否參與該力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　 方法：
　　 1.冷凍干燥法制備殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合三維多孔支架；機械分離與酶消化相結(jié)合分離骺板軟骨細胞；免疫磁珠分選前軟骨干細胞（PSCs），誘導(dǎo)其向軟骨細胞特性方向分化；細胞接種支架體外三維培養(yǎng)，掃描電鏡觀察細胞粘附、增殖，MTT 評估細胞增殖狀況，RT-PCR檢測成軟骨分化指標，阿辛藍

3、法測定細胞蛋白多糖（GAG）
　　 的合成情況。
　　 2.分離并體外培養(yǎng)大鼠骺板軟骨細胞，用自行設(shè)計制作的可控細胞壓力加載裝置對細胞進行不同強度和持續(xù)時間的壓應(yīng)力刺激，采用RT-PCR技術(shù)分別檢測各組軟骨特性細胞外基質(zhì)（Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原以及aggrecan）以及PTHrP mRNA表達并進行半定量分析。
　　 3.大鼠骺板軟骨細胞分組予以動態(tài)壓應(yīng)力和鈣離子拮抗劑硝苯地平作用24 小時。實時定量PCR及West

4、ern blot 檢測分析各組細胞的Sox9 mRNA 及蛋白表達情況；
　　 細胞行Fluo-3/AM 染色，激光共聚焦顯微鏡（LSCM）觀測胞內(nèi)鈣離子熒光強度。
　　 4.免疫磁珠分選骺板前肥大/肥大層軟骨細胞，細胞予以不同強度（3％、6％、12％形變）的動態(tài)張應(yīng)力（1Hz）刺激作用24 小時，實時定量PCR和Western blot 檢測各組細胞的PTHrP mRNA和蛋白的表達情況；流式細胞技術(shù)檢測細胞周期變化。

5、細胞予以一定的張應(yīng)力刺激和細胞骨架松弛素D（2μM），F(xiàn)ITC 標記的鬼筆環(huán)肽行細胞骨架微絲（F-actin）染色，激光共聚焦掃描顯微鏡（LSCM）觀測各組細胞骨架形態(tài)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用冷凍干燥法制備的殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合三維多孔支架具有較好的孔徑及孔隙率；PSCs 體外培養(yǎng)增殖迅速，誘導(dǎo)后的PSCsⅡ型膠原免疫細胞染色及甲苯胺蘭、番紅O 染色陽性；骺板軟骨細胞和誘導(dǎo)后的PSCs 接種支架后生長良好并分泌

6、細胞外基質(zhì)，Sox9、Ⅱ型膠原均陽性表達，培養(yǎng)14天后培養(yǎng)液GAG 含量兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.骺板軟骨細胞在30 mmHg、60 mmHg、90 mmHg 動態(tài)壓力培養(yǎng)環(huán)境下生長良好，各時間點PTHrP、Ⅱ型膠原以及aggrecan mRNA表達水平高于對照組；Ⅹ型膠原表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.骺板軟骨細胞在90 mmHg（12 kPa）動態(tài)壓應(yīng)力下培養(yǎng)24 小時后，實時定量PCR

7、結(jié)果顯示單純壓應(yīng)力組其Sox9 mRNA 及蛋白表達水平明顯高于未受力的對照組；添加硝苯地平的壓應(yīng)力組其Sox9表達水平亦高于對照組，但低于單純壓應(yīng)力組。LSCM 結(jié)果顯示各組胞內(nèi)鈣離子平均熒光強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.動態(tài)張應(yīng)力對骺板前肥大/肥大軟骨細胞PTHrP表達的影響呈劑量和時間依賴性，高強度（12％形變）的張應(yīng)力增加細胞死亡率。強度為6％形變的動態(tài)張應(yīng)力（1Hz）作用24 小時明顯上調(diào)PTHrP表達，LSCM

8、結(jié)果顯示細胞F-actin在受力后發(fā)生重構(gòu)。細胞骨架松弛素D 能部分阻斷應(yīng)力所致的細胞PTHrP表達的上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.PSCs 誘導(dǎo)后向軟骨細胞功能方向分化，與殼聚糖/藻酸鹽三維多孔支架復(fù)合有望用于骺板損傷修復(fù)。
　　 2.適當?shù)膭討B(tài)壓應(yīng)力能有效促進體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細胞Ⅱ型膠原及aggrecanmRNA表達，PTHrP在此細胞力學(xué)信號響應(yīng)過程中可能起重要作用。
　　 3.適當?shù)膭討B(tài)壓