血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的基因修飾與體外三維培養(yǎng)的研究.pdf

1、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞具有定向遷移分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力。參與出生后的血管生成和血管發(fā)生，近年來(lái)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞被廣泛用于治療缺血性心血管疾病和組織工程血管生成的研究中。為了提高血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的移植效率，克服傳統(tǒng)干細(xì)胞移植治療方法中的不足。將血管內(nèi)皮祖細(xì)胞種植于模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的三維載體支架上，進(jìn)行體外培養(yǎng)和體內(nèi)移植，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究采用從大鼠骨髓分離單個(gè)核細(xì)胞，用特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基在體

2、外培養(yǎng)、擴(kuò)增血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。并將構(gòu)建的表達(dá)組織因子途徑抑制因子（TFPI）基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)TFPI和GFP基因的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，用復(fù)乳有機(jī)溶劑揮發(fā)法添加蔗糖做為致孔劑，制備了聚乳酸（poly（D，L-lactide），PDLLA）多孔微球，考察了血管內(nèi)皮祖細(xì)胞在RGD修飾的聚乳酸多孔微球載體上的粘附、增殖、分化情況。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　 為獲得一種方便、有效的血管內(nèi)皮

3、祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增方法，本研究選用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，結(jié)合貼壁培養(yǎng)法，在添加特定生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)體系培養(yǎng)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。通過(guò)觀察其生長(zhǎng)過(guò)程中的形態(tài)改變、檢測(cè)EPCs的功能和表面標(biāo)志來(lái)進(jìn)行鑒定。倒置顯微鏡觀察，在貼壁培養(yǎng)的第4d出現(xiàn)EPCs集落，細(xì)胞呈紡錘形，增長(zhǎng)速度快，于培養(yǎng)的第14天集落相互融合，細(xì)胞分化成鋪路石樣細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察可見大部分EPCs能同時(shí)攝取Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1。熒光顯微

4、鏡觀察到培養(yǎng)14d的EPCs CD31、v-WF免疫熒光染色呈陽(yáng)性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD133、Flk-1在誘導(dǎo)培養(yǎng)的3-7d呈升高趨勢(shì)，至培養(yǎng)的第14d兩者的表達(dá)量明顯降低。在培養(yǎng)的第3、7d，CD31幾乎沒有表達(dá)，至培養(yǎng)的第14d，EPCs的CD31表達(dá)量明顯升高。以上試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)此方法分離培養(yǎng)后得到的細(xì)胞是相對(duì)純度較高的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 為獲得穩(wěn)定表達(dá)TFPI和GFP基因的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，本研究將人全長(zhǎng)TFPI

5、的cDNA亞克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-IRES-GFP中，獲得定向插入重組子pMSCV-TFPI-IRES-GFP，酶切圖譜證實(shí)重組病毒中含有人TFPI的cDNA片段，基因測(cè)序結(jié)果與Genebank中TFPI cDNA序列相符。用構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，成功包裝出含有TFPI和IGFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，將重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染EPCs，熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，90％以上的感染細(xì)胞中存在GFP表達(dá)。RT-PCR分析

6、顯示，重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的。EPCs中TFPI mRNA水平明顯增高，ELISA法檢測(cè)顯示，感染重組病毒的EPCs培養(yǎng)上清中有TFPI蛋白表達(dá)。以上研究結(jié)果為TFPI基因結(jié)合血管內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行血管再狹窄防治的研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 用復(fù)乳有機(jī)溶劑揮發(fā)法，同時(shí)選用蔗糖做為致孔劑，制備了聚乳酸多孔微球，粒徑為100-3001μm左右，微球支架表面孔徑為16±3.78μm，球形態(tài)好，粒徑、孔徑均勻分布，通過(guò)共價(jià)交聯(lián)的方法用

7、RGD修飾PDLLA多孔微球，修飾后的微球形態(tài)無(wú)改變，通過(guò)紅外、XPS等檢測(cè)技術(shù)證實(shí)RGD成功修飾多孔微球表面。本階段的研究為用PDLLA多孔微球作為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的微載體研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 為考察RGD-PDLLA多孔微球支架的生物相容性，將血管內(nèi)皮祖細(xì)胞種植于RGD-PDLLA多孔微球支架，以未經(jīng)RGD修飾的PDLLA微球?yàn)閷?duì)照，通過(guò)MTT、掃描電鏡、熒光染色等生物學(xué)性能檢測(cè)后，對(duì)比研究RGD修飾的PDLLA微球?qū)PC