血管內皮祖細胞的基因修飾與體外三維培養(yǎng)的研究.pdf

1、血管內皮祖細胞是血管內皮細胞的前體細胞具有定向遷移分化為成熟血管內皮細胞的能力。參與出生后的血管生成和血管發(fā)生，近年來血管內皮祖細胞被廣泛用于治療缺血性心血管疾病和組織工程血管生成的研究中。為了提高血管內皮祖細胞的移植效率，克服傳統(tǒng)干細胞移植治療方法中的不足。將血管內皮祖細胞種植于模擬體內細胞外基質結構的三維載體支架上，進行體外培養(yǎng)和體內移植，是近年來研究的熱點。
　　 本研究采用從大鼠骨髓分離單個核細胞，用特定的誘導培養(yǎng)基在體

2、外培養(yǎng)、擴增血管內皮祖細胞。并將構建的表達組織因子途徑抑制因子（TFPI）基因的重組逆轉錄病毒載體包裝成逆轉錄病毒，感染血管內皮祖細胞，獲得穩(wěn)定表達TFPI和GFP基因的血管內皮祖細胞，用復乳有機溶劑揮發(fā)法添加蔗糖做為致孔劑，制備了聚乳酸（poly（D，L-lactide），PDLLA）多孔微球，考察了血管內皮祖細胞在RGD修飾的聚乳酸多孔微球載體上的粘附、增殖、分化情況。具體研究內容如下：
　　 為獲得一種方便、有效的血管內皮

3、祖細胞分離、培養(yǎng)和擴增方法，本研究選用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個核細胞，結合貼壁培養(yǎng)法，在添加特定生長因子的誘導體系培養(yǎng)血管內皮祖細胞。通過觀察其生長過程中的形態(tài)改變、檢測EPCs的功能和表面標志來進行鑒定。倒置顯微鏡觀察，在貼壁培養(yǎng)的第4d出現(xiàn)EPCs集落，細胞呈紡錘形，增長速度快，于培養(yǎng)的第14天集落相互融合，細胞分化成鋪路石樣細胞。熒光顯微鏡觀察可見大部分EPCs能同時攝取Dil-acLDL和結合FITC-UEA-1。熒光顯微

4、鏡觀察到培養(yǎng)14d的EPCs CD31、v-WF免疫熒光染色呈陽性。流式細胞儀檢測結果顯示CD133、Flk-1在誘導培養(yǎng)的3-7d呈升高趨勢，至培養(yǎng)的第14d兩者的表達量明顯降低。在培養(yǎng)的第3、7d，CD31幾乎沒有表達，至培養(yǎng)的第14d，EPCs的CD31表達量明顯升高。以上試驗結果證實此方法分離培養(yǎng)后得到的細胞是相對純度較高的血管內皮祖細胞。
　　 為獲得穩(wěn)定表達TFPI和GFP基因的血管內皮祖細胞，本研究將人全長TFPI

5、的cDNA亞克隆到逆轉錄病毒載體pMSCV-IRES-GFP中，獲得定向插入重組子pMSCV-TFPI-IRES-GFP，酶切圖譜證實重組病毒中含有人TFPI的cDNA片段，基因測序結果與Genebank中TFPI cDNA序列相符。用構建的重組質粒轉染293T細胞，成功包裝出含有TFPI和IGFP基因的逆轉錄病毒，將重組的逆轉錄病毒感染EPCs，熒光顯微鏡觀察及流式細胞儀檢測顯示，90％以上的感染細胞中存在GFP表達。RT-PCR分析

6、顯示，重組的逆轉錄病毒感染的。EPCs中TFPI mRNA水平明顯增高，ELISA法檢測顯示，感染重組病毒的EPCs培養(yǎng)上清中有TFPI蛋白表達。以上研究結果為TFPI基因結合血管內皮祖細胞進行血管再狹窄防治的研究奠定了良好的實驗基礎。
　　 用復乳有機溶劑揮發(fā)法，同時選用蔗糖做為致孔劑，制備了聚乳酸多孔微球，粒徑為100-3001μm左右，微球支架表面孔徑為16±3.78μm，球形態(tài)好，粒徑、孔徑均勻分布，通過共價交聯(lián)的方法用

7、RGD修飾PDLLA多孔微球，修飾后的微球形態(tài)無改變，通過紅外、XPS等檢測技術證實RGD成功修飾多孔微球表面。本階段的研究為用PDLLA多孔微球作為血管內皮祖細胞的微載體研究奠定了基礎。
　　 為考察RGD-PDLLA多孔微球支架的生物相容性，將血管內皮祖細胞種植于RGD-PDLLA多孔微球支架，以未經(jīng)RGD修飾的PDLLA微球為對照，通過MTT、掃描電鏡、熒光染色等生物學性能檢測后，對比研究RGD修飾的PDLLA微球對EPC