MAD2B與TCF4的相互作用及其對(duì)毛乳頭細(xì)胞的作用.pdf

1、一、研究背景和目的：
　　毛囊是皮膚的附屬器官,是毛發(fā)生長的主體,作為人體唯一可以完全循環(huán)再生的器官,毛囊的研究具有重要的生物學(xué)意義;而且毛囊相關(guān)的疾病直接影響患者的外部形象,使患者承受了很大的心理壓力,影響身心健康。因此毛囊的研究日益受到重視。
　　毛乳頭(dermal papilla,DP)位于毛囊的基底部,在毛囊的形態(tài)發(fā)育以及周期性再生調(diào)控中起到關(guān)鍵作用,而且在體外培養(yǎng)中可以誘導(dǎo)毛囊的重建。毛乳頭細(xì)胞(derma lp

2、apilla cells,DPC)是構(gòu)成DP的唯一細(xì)胞,不僅在胚胎期誘導(dǎo)上皮細(xì)胞形成毛囊,而且在出生后調(diào)控成熟毛囊的周期性再生。這種調(diào)控可通過自分泌、旁分泌等方式作用于DPC自身和周邊細(xì)胞,機(jī)制涉及多種信號(hào)通路和調(diào)節(jié)因子,比較重要的有Wnt蛋白、Notch蛋白、骨形成蛋白(BMP)、纖維生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(KGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)等多種蛋白及細(xì)胞因子。因此,DPC是目前毛囊相

3、關(guān)研究的熱點(diǎn)細(xì)胞之一。DPC的重要生物學(xué)特征是凝集性生長,這種特性和DP的功能狀態(tài)相關(guān),其凝集性生長和體外誘導(dǎo)毛囊重建的機(jī)制尚不清楚,各種信號(hào)通路對(duì)DPC的調(diào)節(jié)作用仍需要進(jìn)一步研究。
　　現(xiàn)研究證實(shí),Wnt通路在毛發(fā)發(fā)育和周期調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用,對(duì)維持DPC的凝集生長能力有著關(guān)鍵的作用。我科前期實(shí)驗(yàn)證實(shí),Wnt信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子T細(xì)胞生長因子4(T cell factor,TCF4)在凝集生長的DPC特異表達(dá),增強(qiáng)TCF4

4、的表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的DPC有明顯促進(jìn)作用,并可以促進(jìn)DPC中SCF、HGF等外分泌因子的表達(dá),通過自分泌和旁分泌機(jī)制調(diào)控毛囊的發(fā)育。MAD2B(mitotic arrest deficient 2-like2,又稱MAD2L2)蛋白是通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)的可與TCF4結(jié)合的蛋白,在有絲分裂的周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。本課題擬研究在凝集狀態(tài)下生長的DPC中是否存在MAD2B蛋白和TCF4的相互作用,以及其是否對(duì)TCF4調(diào)控的Wnt信號(hào)通路活

5、性和下游細(xì)胞因子的表達(dá)存在調(diào)控作用,是否影響DPC的生物學(xué)功能。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：
　　1、從人頭皮毛囊中分離培養(yǎng)DPC,觀察原代及其傳代的DPC生長特性,提取其總的RNA,以供后續(xù)試驗(yàn)。
　　2、利用免疫共沉淀技術(shù)測定在DPC中MAD2B蛋白和TCF4蛋白存在相互作用。
　　3、構(gòu)建pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定后使用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

6、轉(zhuǎn)染至DPC,使用倒置熒光顯微鏡、Western blot明確其在DPC內(nèi)存在過表達(dá),質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染成功。
　　4、設(shè)置試驗(yàn)分組:pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組,pIRES2-TCF4轉(zhuǎn)染組,正常DPC對(duì)照組。結(jié)果證實(shí),與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pIRES2-TCF4組相比,共轉(zhuǎn)染pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4后Wnt/β-catenin信號(hào)有明顯的降低(p<0.05),而siMAD2B和pIRES

7、2-TCF4共轉(zhuǎn)染后則能糾正這種降低。pIRES2-TCF4轉(zhuǎn)染組和siMAD2B、pIRES2-TCF4共轉(zhuǎn)染組的Wnt/β-catenin信號(hào)都比對(duì)照組有明顯的升高(p<0.05)。使用CCK-8測定對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響,pIRES2-MAD2B、pIRES2-TCF4共轉(zhuǎn)染組的D450平均值為0.49±0.18,pIRES2-TCF4轉(zhuǎn)染組D450平均值為0.79±0.15,正常DP對(duì)照組D450平均值為0.57±0.15。其中p

8、IRES2-TCF4轉(zhuǎn)染組與pIRES2-MAD2B、pIRES2-TCF4共轉(zhuǎn)染組和正常DP對(duì)照組有明顯差異(p<0.05);pIRES2-MAD2B、pIRES2-TCF4共轉(zhuǎn)染組與正常DP組未見明顯差異。
　　5、通過熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn),在MAD2B過表達(dá)的DPC,其分泌的細(xì)胞因子IGF-1、VEGF和HGF的mRNA的表達(dá),相對(duì)于正常對(duì)照組有明顯減少。
　　三、結(jié)論：
　　1、免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)MAD2B