BTLA與HVEM相互作用對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié).pdf

1、T細(xì)胞的活化需要雙信號(hào)的刺激，T細(xì)胞抗原受體特異性識(shí)別MHC/抗原肽產(chǎn)生第一信號(hào)，共刺激分子的活化產(chǎn)生第二信號(hào)。共刺激分子和共抑制分子統(tǒng)稱為共信號(hào)分子。免疫球蛋白超家族（IgSF）中的共刺激分子CD28和ICOS具有促進(jìn)T細(xì)胞活化的作用，而共抑制分子CTLA-4、PD-1和新近發(fā)現(xiàn)的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞衰減子（B and T lymphocyte attenuator， BTLA）具有抑制T細(xì)胞的作用。 BTLA分子具有IgS

2、F的結(jié)構(gòu)特征，胞外段包含一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)樣結(jié)構(gòu)域（IgV），胞內(nèi)含有兩個(gè)免疫受體酪氨酸抑制性基序（ITIMs）。ITIMs磷酸化，可以募集酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，產(chǎn)生抑制效應(yīng)。BTLA在小鼠B淋巴細(xì)胞上表達(dá)量很高，T淋巴細(xì)胞和DC上的表達(dá)次之，巨噬細(xì)胞的表達(dá)在不同小鼠中具有多態(tài)性，NK細(xì)胞表達(dá)很少。在T細(xì)胞活化過程中，BTLA表現(xiàn)出和CTLA-4、PD-1不同的調(diào)節(jié)模式。CTLA-4和PD-1誘導(dǎo)活化后表達(dá)在T細(xì)胞上，B

3、TLA組成性表達(dá)在T細(xì)胞表面，活化后維持高水平表達(dá)。研究表明，BTLA可以抑制T細(xì)胞的增殖及IL-2和IFNγ的分泌，BTLA-/-T細(xì)胞對(duì)DC提呈的抗原刺激增殖更明顯。盡管BTLA屬于IgSF成員，然而其配體卻是TNFR家族的HVEM。這是兩大家族相互作用的唯一分子對(duì)，更特別的是，BTLA具有抑制T細(xì)胞的功能，而HVEM卻可以活化NF-κB和AP-1，增強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)。HVEM表達(dá)在靜止T細(xì)胞和未成熟DC細(xì)胞上，隨著T細(xì)胞活化和DC的成

4、熟，表達(dá)降低，HVEM和FNF家族配體LIGHT結(jié)合，可以下調(diào)HVEM的表達(dá)。用LIGHT刺激HVEM能夠維持T細(xì)胞的存活和炎癥反應(yīng)。然而，表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞上的HVEM和HVEM-Fc融合蛋白和T細(xì)胞上的BTLA結(jié)合后，產(chǎn)生抑制T細(xì)胞的作用。小鼠的研究表明，BTLA信號(hào)可以防止自身免疫性疾病的發(fā)生，終止炎癥反應(yīng)，抑制移植免疫應(yīng)答，因此，BTLA信號(hào)在外周免疫耐受的調(diào)節(jié)中，具有重要作用。 BTLA/HVEM/LIGHT的表達(dá)和作

5、用方式，構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，連接了IgSF和TNFR兩大家族的信號(hào)，因此是T細(xì)胞精確而又細(xì)微的調(diào)節(jié)自身活化的重要機(jī)制，在適時(shí)終止過度激活的免疫應(yīng)答中具有重要作用。 本研究首先分析了BTLA在人T細(xì)胞活化的起始和早期階段免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用。進(jìn)而以人Treg細(xì)胞作為研究對(duì)象，揭示了BTLA信號(hào)是Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答的新途徑。最后以表達(dá)人HVEM的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞免疫小鼠，成功研制了一株鼠抗人HVEM的單克隆抗體。

6、 第一部分、交聯(lián)鼠抗人BTLA單抗或HVEM-Fc融合蛋白介導(dǎo)BTLA對(duì)T細(xì)胞活化的抑制。 目的：利用鼠抗人BTLA單克隆抗體8H9和HVEM-Fc融合蛋白的不同作用方式，觀察它們對(duì)T細(xì)胞的作用，為探討B(tài)TLA在T淋巴細(xì)胞上的功能提供研究手段。 方法：分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)陰性選擇磁珠分離純化獲得T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BTLA在不同T淋巴細(xì)胞亞群上的表達(dá)。進(jìn)一步用PHA或激發(fā)型抗人CD3單抗包板刺激T淋巴細(xì)胞活

7、化，MTT法檢測(cè)游離、包被以及抗Fc段二抗交聯(lián)的8H9或HVEM-Fc融合蛋白對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。 結(jié)論：BTLA單抗8H9及HVEM-Fc融合蛋白經(jīng)包被或抗Fc段二抗交聯(lián)后可以介導(dǎo)BTLA對(duì)T細(xì)胞活化的抑制作用，但游離在液體中則不能激發(fā)BTLA信號(hào)，利用這一生物學(xué)特性為進(jìn)一步研究BTLA對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用提供了有效的手段。 第二部分、BTLA對(duì)T細(xì)胞活化的起始和早期階段免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。 目的：觀

8、察BTLA在T細(xì)胞上的表達(dá)并探討其在各個(gè)階段不同時(shí)相對(duì)T細(xì)胞活化的抑制。 方法：分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)陰性選擇磁珠分離純化獲得T淋巴細(xì)胞。流式檢測(cè)新鮮分離T細(xì)胞上BTLA、HVEM、LIGHT、CTLA-4和PD-1的表達(dá)；用CD3抗體刺激T細(xì)胞活化，比較BTLA、CTLA-4和PD-1在T細(xì)胞活化過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。CD3抗體在加入或不加入BTLA單抗8H9的情況下刺激T細(xì)胞活化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期活化標(biāo)志分子CD25和CD

9、69的表達(dá)。CD3抗體單獨(dú)或聯(lián)合CD28抗體活化T細(xì)胞，在不同的活化時(shí)間，MTT檢測(cè)BTLA單抗8H9對(duì)T細(xì)胞增殖的影響。外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)貼壁，GM-CSF和IL-4體外誘導(dǎo)生成未成熟DC，CD40抗體刺激DC成熟，流式檢測(cè)HVEM在DC上的表達(dá)。用DC誘導(dǎo)異基因T細(xì)胞活化，加入游離8H9或抗HVEM抗體，阻斷HVEM和BTLA結(jié)合，MTT檢測(cè)T細(xì)胞增殖。 結(jié)論：BTLA可以提高T細(xì)胞的活化閾值，抑制T細(xì)胞早期活化分子CD25

10、和CD69的表達(dá)，在T細(xì)胞活化的起始和早期階段發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用。 第三部分、HVEM在人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上的表達(dá)及功能研究。 目的：研究HVEM在人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞上的表達(dá)及其對(duì)Treg細(xì)胞功能的影響。 方法：分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，磁珠純化獲得T細(xì)胞及其不同亞群，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞上HVEM的表達(dá)。用CD3抗體分別活化CD3+T細(xì)胞或Treg

11、細(xì)胞，流式檢測(cè)HVEM的動(dòng)態(tài)表達(dá)。Treg細(xì)胞按不同比例分別與去除Treg細(xì)胞的CD3+T細(xì)胞、CD4+CD25-T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞混合培養(yǎng)，加入抗HVEM抗體或同型對(duì)照抗體，并用CD3抗體單獨(dú)或聯(lián)合CD28抗體刺激T細(xì)胞，MTT檢測(cè)T細(xì)胞增殖。 結(jié)論：HVEM在Treg細(xì)胞上高表達(dá)介導(dǎo)了Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的抑制功能，是Treg細(xì)胞通過細(xì)胞之間直接接觸發(fā)揮抑制作用的又一新分子。 第四部分、鼠抗人HVEM單克隆抗

12、體的研制。 目的：研制鼠抗人HVEM單克隆抗體，為探討HVEM/BTLA相互作用對(duì)人T細(xì)胞的抑制性調(diào)節(jié)提供研究手段。 方法：以高表達(dá)人HVEM的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/HVEM為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，并以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/HVEM和L929/mock分別作為陽性和陰性篩選細(xì)胞。采用間接免疫熒光標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)篩選雜交瘤克隆。經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，獲得特異性分泌鼠抗人HVEM分子

13、單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用細(xì)胞核染色體計(jì)數(shù)、Ig亞類快速定性試紙法對(duì)所獲雜交瘤和單抗進(jìn)行鑒定。用間接免疫熒光法初步分析單抗與T細(xì)胞及DC上HVEM的結(jié)合反應(yīng)，并用MTT法檢測(cè)其對(duì)Treg細(xì)胞抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)論：成功獲得1株穩(wěn)定分泌鼠抗人HVEM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，從而為研究HVEM/BTLA抑制信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用提供了物質(zhì)手段。 綜上所述，本研究應(yīng)用BTLA單抗8H9和HVEM-Fc融合蛋白模

14、擬BTLA信號(hào)，表明包被和交聯(lián)的單抗或Fc融合蛋白可以激發(fā)BTLA信號(hào)，而游離在液體中，不能產(chǎn)生抑制信號(hào)，這為研究BTLA的功能提供了手段；BTLA信號(hào)能抑制T細(xì)胞早期活化分子CD25和CD69的表達(dá)，提高T細(xì)胞活化閾值，并在T細(xì)胞活化的48h內(nèi)可以發(fā)揮抑制作用，即T細(xì)胞活化的起始和早期階段發(fā)揮抑制作用，這有助于更全面和深入地理解負(fù)性信號(hào)分子在免疫應(yīng)答中的作用和地位；CD4+CD25+Treg細(xì)胞高表達(dá)HVEM，并且HVEM/BTLA相