BRAP相互作用蛋白的篩選及其對細(xì)胞氧化代謝功能的影響.pdf

1、蛙皮素受體亞型-3（BRS-3）是蛙皮素樣肽家族的成員之一，研究顯示其可能在肺和氣道上皮應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮一定作用。蛙皮素受體激活蛋白(BRAP)是本課題組前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的能與BRS-3相互作用的新蛋白。本課題組前期研究提示BRAP參與應(yīng)激條件下應(yīng)激信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激條件下某些特定生理功能的調(diào)控。為了進(jìn)一步研究BRAP的作用機(jī)制并深入探討其生物學(xué)功能，本研究通過酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行了BRAP相互作用蛋白的篩選并將已篩選的蛋白根據(jù)其功能進(jìn)行歸

2、類，推測BRAP與細(xì)胞氧化代謝功能具有著密切的聯(lián)系并進(jìn)行了一系列細(xì)胞氧化代謝相關(guān)的檢測。
　　目的:篩選與BRAP相互作用的蛋白并研究其對細(xì)胞氧化代謝功能的影響，以進(jìn)一步探究BRAP的功能及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　(1)酵母雙雜交篩選BRAP相互作用蛋白。
　　(2)分析篩選出可能的BRAP相互作用蛋白，并克隆其基因全長用酵母雙雜交初步驗(yàn)證初篩的與氧化代謝有關(guān)的基因產(chǎn)物與BRAP之間的相互作用。
　　

3、(3)采用活性氧探針法檢測BRAP對靜息狀態(tài)下和臭氧攻擊后HEK293T細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響。
　　(4)利用報(bào)告基因pARE-Luc探究BRAP高表達(dá)對HEK293T細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響。
　　(5)流式細(xì)胞術(shù)及熒光分光光度計(jì)檢測BRAP對HEK293T細(xì)胞凋亡的影響。
　　(6)通過化學(xué)發(fā)光法檢測BRAP對臭氧應(yīng)激后反映細(xì)胞凋亡的線粒體途徑caspase-9活性的影響。
　　(7)利用熒光分光光度計(jì)檢測

4、BRAP對臭氧應(yīng)激后HEK293T細(xì)胞線粒體膜電位的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)獲得20個(gè)可與BRAP相互作用蛋白的基因，其中包括一些參與細(xì)胞氧化代謝活動(dòng)的酶類。
　　(2)成功克隆部分目的基因全長，并初步驗(yàn)證了3個(gè)能與BRAP發(fā)生相互作用的目的基因。
　　(3) BRAP高表達(dá)可以降低臭氧應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的含量，并且降低細(xì)胞內(nèi)氧化代謝水平。
　　(4) BRAP高表達(dá)可以減少臭氧應(yīng)激后的細(xì)