念珠菌病細(xì)胞免疫機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：檢測(cè)陰道念珠菌病小鼠模型中趨化因子及其受體的表達(dá)，探討趨化因子及其受體在小鼠陰道念珠菌病發(fā)病中的作用。
　　 方法：將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為A組(雌激素處理感染組)、B組(雌激素處理未感染組)、C組(未用雌激素處理感染組)及正常組，前3組又分為2d、4d、7d、14d 及21d組，每組各5 只。建立陰道念珠菌病小鼠模型，從微生物學(xué)及組織病理學(xué)角度對(duì)小鼠的感染狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估，繼之以RT-PCR、Real-ti

2、me RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色SABC法及ELISA方法檢測(cè)接種白念珠菌后各時(shí)間點(diǎn)小鼠陰道粘膜及腰淋巴結(jié)中趨化因子及其受體的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)陰道真菌載量：A組小鼠陰道內(nèi)為持續(xù)感染，其真菌載量持續(xù)維持在高水平，菌絲評(píng)分與感染的嚴(yán)重程度有關(guān)；B組小鼠整個(gè)21d 觀察不到任何真菌菌落；C組小鼠早期(2～7d)真菌載量較A組低(P<0.05)，第14d 真菌載量迅速下降，第21d基本觀察不到真菌菌落。(2)陰道粘膜病理學(xué)

3、改變：A組小鼠白念珠菌接種后第2d，陰道腔內(nèi)即可見少量紫紅色線狀菌絲，有PMNs 浸潤(rùn)；第4d 陰道腔內(nèi)可見成團(tuán)紫紅色線狀菌絲及卵圓形孢子，同時(shí)見大量PMNs；第7d 不僅陰道腔內(nèi)可見成團(tuán)菌絲及孢子，亦可見菌絲及孢子由粘膜表面向角質(zhì)上皮穿透，陰道腔內(nèi)、陰道粘膜及粘膜下可見大量的以PMNs為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；第14d 陰道腔內(nèi)可見部分菌絲斷裂；第21d 陰道腔內(nèi)斷裂菌絲較前增多。C組小鼠接種后第2～7d 病理改變基本同A組，第14d 時(shí)陰

4、道腔內(nèi)僅見少量菌絲，21d 時(shí)未見明顯菌絲及孢子。B組小鼠陰道腔及陰道粘膜未見菌絲及孢子。(3)雌激素對(duì)陰道粘膜及淋巴結(jié)趨化因子及其受體的mRNA 表達(dá)無明顯影響。所有感染組小鼠的陰道粘膜趨化因子及其受體的mRNA 水平均明顯升高(P<0.05)，其中A組小鼠陰道趨化因子水平持續(xù)維持在較高水平，C組小鼠在感染消退時(shí)(第14d和21d 時(shí))其陰道趨化因子的產(chǎn)生亦降至基礎(chǔ)水平；而相應(yīng)的趨化因子受體在A組和C組小鼠陰道粘膜均見明顯升高(P<0

5、.05)。與之不同的是，在腰引流淋巴結(jié)，感染組小鼠MCP-1、MCP-2、IP-10 及MIG 均未見明顯改變(P>0.05)，SDF-1 則在A組小鼠感染后第2d，7～21d 明顯升高(P<0.05)，C組無明顯變化(P>0.05)。
　　 趨化因子受體CCR2在A組小鼠感染后第7～21d 明顯升高(P<0.05)，C組無明顯變化(P>0.05)；CXCR3分別在A、C組小鼠感染后第7d、第4～14d 明顯升高；CXCR4分別

6、在A、C組小鼠感染后第2～21d，7～14d 明顯升高(P<0.05)。(4)對(duì)A組小鼠陰道粘膜MCP-1、CCR2 及IP-10 mRNA 水平進(jìn)一步行Real-time RT-PCR 定量分析：MCP-1mRNA在感染后各時(shí)間點(diǎn)均明顯升高(P<0.05)，第14d 達(dá)高峰(升高9.254 倍)；CCR2在感染后第7～21d 明顯升高(P<0.05)，第7d 達(dá)高峰(升高5.278 倍)；IP-10在感染后第7～21d 明顯升高(P<

7、0.05)，第14d 達(dá)高峰(升高7.013 倍)。以MCP-1 升高最為明顯。(5)免疫組化結(jié)果顯示A組小鼠陰道粘膜中趨化因子MCP-1、SDF-1 及CXCR4主要在角質(zhì)形成細(xì)胞上表達(dá)，MCP-1 位于胞核及胞漿，SDF-1 及CXCR4 則主要位于胞漿及胞膜。此外，固有層中浸潤(rùn)的部分炎性細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿亦可見MCP-1、SDF-1 及CXCR4 表達(dá)。B組及正常組小鼠陰道粘膜未見MCP-1、SDF-1 及CXCR4的表達(dá)。

8、半定量分析結(jié)果表明：A組小鼠在接種白念珠菌后各時(shí)間點(diǎn)MCP-1、SDF-1 及CXCR4 表達(dá)均明顯增加(P<0.05)。其中MCP-1在接種后第2d 即見表達(dá)，2周時(shí)達(dá)高峰并持續(xù)到第3周。SDF-1 及CXCR4的表達(dá)在接種后第2d 即開始增加，第7d 時(shí)達(dá)高峰，第14d和21d 開始下降。(6)對(duì)小鼠陰道粘膜及淋巴結(jié)MCP-1蛋白水平行ELISA檢測(cè)，可見MCP-1在A組小鼠感染后各時(shí)間點(diǎn)均明顯升高，C組小鼠感染后第7d 明顯升高(

9、P<0.05)；而腰淋巴結(jié)MCP-1在感染前后無明顯改變(P>0.05)。
　　 (7)陰道灌洗液涂片后染色顯示，PMNs、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其他類型白細(xì)胞所占比例在白念珠菌感染或雌激素造成的假發(fā)情狀態(tài)下無明顯改變(P>0.05)。
　　 結(jié)論：趨化因子及其受體可能在局部陰道黏膜白念珠菌感染中起一定的作用。此外，SDF-1及趨化因子受體亦可能參與淋巴結(jié)對(duì)白念珠菌的防御。
　　 第二部分
　　 目的：研究

10、白念珠菌與樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)相互作用后，白念珠菌對(duì)DC吞噬功能、表面標(biāo)志及其電生理學(xué)特性的影響，體外水平探討DC在機(jī)體抵御白念珠菌感染中可能的作用。
　　 方法：(1)將白念珠菌加入DC2.4 細(xì)胞培養(yǎng)基中，動(dòng)態(tài)觀察二者共孵育后30min，1h及2h后DC2.4的吞噬功能。(2)應(yīng)用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)與白念珠菌共孵育前、孵育后2h及4h時(shí)DC2.4 表面MHCⅡ及共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)。

11、(3)應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式觀察白念珠菌對(duì)DCIk(delayed rectifier potassium current，延遲整流鉀電流)的影響及伊曲康唑注射液(斯皮仁諾)對(duì)白念珠菌致DCIk電流增加的影響。(4)應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察白念珠菌對(duì)DC2.4 細(xì)胞內(nèi)鈣濃度(intracellular calciumconcentration，[Ca2+]I)的影響及伊曲康唑、氟康唑注射液(大扶康)分別對(duì)靜息狀態(tài)下DC[Ca2+]

12、I及白念珠菌致DC[Ca2+]I升高的影響。
　　 結(jié)果：(1)DC2.4與白念珠菌共孵育30min，1h及2h后，吞噬百分率分別為74.76±
　　 1.04[％]，76.42±1.13[％]及90.99±1.42[％]；吞噬指數(shù)分別為1.328±0.023，2.386±0.041,3.844±0.037。(2)與孵育前相比，孵育后2h DC2.4 細(xì)胞上CD80分子的表達(dá)顯著上升，細(xì)胞陽性比率由孵育前41.22[％]

13、升至73.91[％]，平均熒光強(qiáng)度也由61.34 升至81.94(P<0.05)；孵育后4h CD80分子的表達(dá)有所下降，細(xì)胞陽性比率50.85[％]，平均熒光強(qiáng)度57.52；但較孵育前仍升高(P<0.05)。CD86在孵育前已高表達(dá)，細(xì)胞陽性比率98.92[％]，故孵育后表達(dá)變化不明顯，2h和4h分別為96.93[％]和93.57[％](P>0.05)。 MHCⅡ在孵育前僅1.13[％]，熒光強(qiáng)度48.36；孵育后2h升至3.79[％

14、]，熒光強(qiáng)度56.13(P<0.05)；4h降為0.64[％]，熒光強(qiáng)度43.17，較孵育前無明顯改變(P>0.05)。(3)白念珠菌使DC2.4細(xì)胞Ik峰值可逆性升高(30.03±5.76)[％]，用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液洗脫白念珠菌后Ik電流可部分恢復(fù)。伊曲康唑本身對(duì)DC2.4 細(xì)胞Ik峰值無明顯影響(P>0.05)，其與DC2.4 預(yù)孵育10min后可使白念珠菌致DCIk電流增加的幅度減小(P<0.05)。此外，白念珠菌可使DC2.4 Ik

15、的I-V曲線升高。(4)白念珠菌使DC2.4 細(xì)胞[Ca2+]I熒光強(qiáng)度增加，且呈濃度依賴性。伊曲康唑本身即可使DC2.4 細(xì)胞[Ca2+]I熒光強(qiáng)度降低，與DC2.4 預(yù)孵育后可使白念珠菌致DC[Ca2+]I升高的幅度減小(P<0.05)。氟康唑?qū)C[Ca2+]I及白念珠菌致DC[Ca2+]I的升高無明顯影響(P>0.05)。
　　 結(jié)論:(1)白念珠菌可能通過升高DCIk電流及[Ca2+]I而促進(jìn)其表面CD80 及MHCⅡ