靶向性凝血蛋白tTF-EG3287選擇性誘發(fā)小鼠原位肝癌血管栓塞.pdf

1、肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差的特點(diǎn)，經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）是目前公認(rèn)的肝癌非手術(shù)治療的首選方法。目前臨床上常用的栓塞材料各有優(yōu)缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中如何對(duì)癥使用尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，而且TACE治療能否提高肝癌病人的生存率，仍然存在爭(zhēng)議，TACE治療存在種種缺陷如栓塞不全、缺乏靶向性、毒副作用大、栓塞劑穩(wěn)定性與可控性差和伴隨血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子升高等。因

2、此，發(fā)展新型高效的、具有靶向性、可控性強(qiáng)、無(wú)毒的腫瘤血管栓塞劑依然是目前肝癌臨床治療亟待解決的重大問(wèn)題。
　　針對(duì)以上問(wèn)題，我們計(jì)劃采用一種基于靶向性凝血蛋白的選擇性栓塞腫瘤血管的抗腫瘤策略。該方法利用截短的組織因子（truncated tissue factor，tTF，又稱前體凝血酶或凝血蛋白）作為凝血效應(yīng)因子，腫瘤血管標(biāo)志物結(jié)合配體EG3287為載體，其中EG3287為VEGF165與Neuropilin-1（NRP-1，V

3、EGF的共受體）結(jié)合的核心區(qū)域設(shè)計(jì)出的短肽，構(gòu)建的靶向性融合蛋白tTF-EG3287能夠通過(guò)載體把具有潛在凝血功能的tTF選擇性地傳遞到腫瘤血管，tTF借結(jié)合的靶細(xì)胞膜平臺(tái)恢復(fù)凝血酶的活力，并誘發(fā)腫瘤血管凝血反應(yīng)、血栓形成和栓塞阻斷腫瘤組織的血液供應(yīng)，從而產(chǎn)生抗腫瘤活性。
　　為了驗(yàn)證靶向性凝血蛋白tTF-EG3287在原位肝癌的抗腫瘤活性，我們首先通過(guò)大腸桿菌BL21(DE3)大量表達(dá)tTF-EG3287，破碎菌體得到融合蛋白，

4、經(jīng)過(guò)尿素變性后過(guò)鎳柱親和純化，然后將純化后的蛋白透析復(fù)性，通過(guò)凝血時(shí)間測(cè)定和FX活化實(shí)驗(yàn)在體外初步研究了該融合蛋白的凝血活性。然后利用H22肝癌細(xì)胞株構(gòu)建小鼠移植性原位肝癌模型，使用Cy5.5熒光標(biāo)記tTF-EG3287的方法尾靜脈注射原位肝癌模型小鼠中，觀察其在主要臟器和肝癌組織中的分布。最后通過(guò)尾靜脈小鼠給藥，組織切片法觀察凝血蛋白對(duì)肝癌組織血管的栓塞作用，同時(shí)利用免疫組織化學(xué)法分析正常組織和肝癌組織中的NRP-1和VEGFR表達(dá)情

5、況，評(píng)價(jià)凝血蛋白tTF-EG3287的抗腫瘤活性。
　　本實(shí)驗(yàn)成功地利用大腸桿菌BL21(DE3)優(yōu)化表達(dá)融合蛋白tTF-EG3287，表達(dá)的包涵體蛋白經(jīng)過(guò)高濃度尿素變性后過(guò)鎳柱純化，純度達(dá)到95％，復(fù)性濃縮后蛋白濃度達(dá)1 mg/ml，凝血時(shí)間測(cè)定和FX活化實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有凝血活性。熒光定位實(shí)驗(yàn)顯示tTF-EG3287能選擇性富集于肝癌組織，免疫化學(xué)結(jié)果顯示肝癌組織中均高表達(dá)NRP-1和VEGFR蛋白，病理學(xué)觀察可見(jiàn)tTF-EG32