LAIRs和膠原分子調(diào)節(jié)人早孕蛻膜NK細(xì)胞功能的分子機(jī)制.pdf

1、妊娠是一個(gè)獨(dú)特的免疫學(xué)事件。妊娠成功需要通過(guò)精細(xì)的母-胎對(duì)話，在母-胎界面建立獨(dú)特的免疫耐受微環(huán)境。母-胎界面多種細(xì)胞和分子之間的對(duì)話是母-胎調(diào)節(jié)的核心內(nèi)容，解析其中的免疫細(xì)胞，滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)它們表面膜分子和分泌的細(xì)胞因子之間的相互作用，是闡明母-胎免疫耐受機(jī)制的重要研究?jī)?nèi)容，不僅對(duì)生殖免疫學(xué)，而且對(duì)腫瘤和移植免疫學(xué)都具有重要的理論和臨床意義。
　　白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體(LAIR)是新近鑒定的以膠原為配體的免疫受

2、體。LAIR-1廣泛表達(dá)在造血細(xì)胞和各類(lèi)免疫細(xì)胞表面，胞質(zhì)區(qū)有ITIM基序，LAIR-1對(duì)外周血免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用及其在腫瘤免疫和移植免疫中的意義是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。然而，在生殖免疫學(xué)中，目前還沒(méi)有任何相關(guān)研究。膠原蛋白作為母-胎界面含量豐富的重要細(xì)胞外基質(zhì)，在妊娠維持以及免疫調(diào)節(jié)中的作用研究也甚少。蛻膜NK細(xì)胞約占蛻膜免疫細(xì)胞總數(shù)的70％，其表型和生物學(xué)行為對(duì)母-胎免疫耐受的形成發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
　　本研究在分析了LA

3、IRs和膠原分子在母-胎界面的表達(dá)及其和自然流產(chǎn)關(guān)系的基礎(chǔ)上，從LAIR-1和膠原分子的相互作用對(duì)在母-胎界面占絕對(duì)組成優(yōu)勢(shì)的早孕期NK細(xì)胞的調(diào)控入手，以解析滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)表達(dá)的膠原蛋白和LAIRs的相互作用對(duì)NK細(xì)胞表型和生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)，并進(jìn)一步研究JAK-STAT信號(hào)通路在此調(diào)節(jié)中的角色。研究成果可以為臨床上全面理解自然流產(chǎn)等母-胎免疫調(diào)節(jié)紊亂性疾病提供新的視角，同時(shí)對(duì)相關(guān)疾病的診斷和防治也可提供新的靶點(diǎn)和思路。

4、>　　第一部分 LAIR-1和膠原分子的表達(dá)水平與自然流產(chǎn)相關(guān)
　　目的：分析比較LAIR家族成員(LAIRs)和膠原分子在正常和異常妊娠組織中的表達(dá);以及在體外培養(yǎng)的正常和流產(chǎn)的滋養(yǎng)細(xì)胞，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞和NK細(xì)胞中的表達(dá)。
　　方法：收集正常和異常妊娠早孕期婦女的絨毛和蛻膜組織，采用馬松染色法(Masson)和免疫組化技術(shù)(IH)分析LAIR-1和膠原分子在其中的表達(dá)情況;分離各種早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(DSC)和蛻膜

5、免疫細(xì)胞(DIC)，采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等技術(shù)分析以上細(xì)胞中多種LAIRs和膠原分子表達(dá)的情況;用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析正常和流產(chǎn)組織蛻膜NK細(xì)胞LAIR-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：獲得了較全面的LAIRs和膠原分子在正常妊娠和自然流產(chǎn)組織中的表達(dá)情況。對(duì)比分析結(jié)果顯示:正常妊娠的絨毛和蛻膜組織相對(duì)于自然流產(chǎn)的絨毛和蛻膜組織，都有更高水平膠原的表達(dá);體外培養(yǎng)的正常滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞在mRNA和

6、蛋白水平也都比自然流產(chǎn)的滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)分泌更高水平的膠原蛋白;正常妊娠的蛻膜組織比自然流產(chǎn)的蛻膜組織表達(dá)更高的LAIR-1，并且正常妊娠的蛻膜NK也比自然流產(chǎn)的蛻膜NK細(xì)胞表達(dá)更高水平的LAIR-1。
　　結(jié)論：人早孕期母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的膠原蛋白表達(dá)下降和自然流產(chǎn)具有相關(guān)性;蛻膜組織和蛻膜NK細(xì)胞LAIR-1的低表達(dá)與自然流產(chǎn)也有相關(guān)性。
　　第二部分 LAIRs和膠原分子相互作用調(diào)節(jié)NK細(xì)胞表型

7、
　　目的：解析LAIR-1和膠原分子相互作用的特點(diǎn)，及其對(duì)外周NK細(xì)胞及蛻膜NK細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：常規(guī)無(wú)菌分離外同血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和蛻膜免疫細(xì)胞(DIC)后，磁珠分選其中的外周NK細(xì)胞和蛻膜NK細(xì)胞，并在其體外培養(yǎng)體系中加入不同濃度的膠原分子，用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和流式細(xì)胞(FCM)技術(shù)分析膠原分子受體LAIR-1的表達(dá)情況;進(jìn)一步在早孕期NK細(xì)胞培養(yǎng)體系加入膠原蛋白分子

8、，并且設(shè)立LAIR-2處理組，用FCM分析NK細(xì)胞表面的激活性受體和抑制性受體以及細(xì)胞內(nèi)Th1、Th2型細(xì)胞因子和殺傷活性相關(guān)分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：膠原蛋白分子可以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)其受體LAIR-1在NK細(xì)胞mRNA和蛋白水平表達(dá)增加。膠原蛋白分子可以通過(guò)和LAIR-1的相互作用降低蛻膜NK細(xì)胞表面激活性受體NKp30的表達(dá)，上調(diào)抑制性受體KIR2DL1的表達(dá);膠原蛋白分子和LAIR-1的相互作用也可以降低蛻膜NK細(xì)胞Th1

9、型細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的表達(dá)，而不影響蛻膜NK細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10的表達(dá);高濃度膠原蛋白分子可以降低蛻膜NK細(xì)胞穿孔素的表達(dá)，且后者的表達(dá)和LAIR-1表達(dá)的熒光強(qiáng)度成反比，這種作用以及膠原蛋白分子對(duì)NK細(xì)胞表型和Th1型細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)都可以被LAIR-2所拮抗。
　　結(jié)論：膠原分子上調(diào)NK細(xì)胞中LAIR-1的表達(dá)，并且通過(guò)和LAIR-1的相互作用可以降低NK細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子和穿孔素的表達(dá)，誘

10、導(dǎo)蛻膜NK細(xì)胞的耐受表型。
　　第三部分 滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)膠原分子參與調(diào)節(jié)蛻膜NK細(xì)胞的功能
　　目的：解析人早孕期母-胎界面的滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)表達(dá)的膠原蛋白分子對(duì)蛻膜NK細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：在體外建立人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、以及滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系來(lái)模擬早孕期母-胎界面微環(huán)境，然后與純化的蛻膜NK細(xì)胞共培養(yǎng)，并設(shè)立LAIR-2處理組，用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分

11、析蛻膜NK細(xì)胞的表面激活性受體和抑制性受體以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和殺傷活性相關(guān)分子的表達(dá)。進(jìn)一步用P4H shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞來(lái)模擬自然流產(chǎn)的母-胎界面膠原蛋白分子低水平表達(dá)的微環(huán)境，用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法和氨基酸分析儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染處理后，滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中膠原蛋白的表達(dá)水平;然后用FCM分析蛻膜NK細(xì)胞表面的激活性受體和抑制性受體以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和殺傷活性相關(guān)

12、分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)分泌膠原分子與LAIR-1相互作用降低蛻膜NK細(xì)胞表面激活性受體NKp30的表達(dá)，上調(diào)抑制性受體KIR2DL1的表達(dá);也可以降低蛻膜NK細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α，以及穿孔素的表達(dá)。用LAIR-2阻斷和P4H shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以基因沉默膠原合成，都能夠抑制滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對(duì)蛻膜NK細(xì)胞的表面受體、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子以及殺傷活性的調(diào)節(jié)作用。值得一提的是，用P4

13、H shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞會(huì)使蛻膜NK細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10的表達(dá)水平下降。
　　結(jié)論：人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)表達(dá)的膠原分子參與調(diào)節(jié)蛻膜NK細(xì)胞的功能，從而有利于正常妊娠的維持。
　　第四部分 JAK-STAT信號(hào)通路參與LAIR-1對(duì)NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
　　目的：解析LAIR-1調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能的信號(hào)通路。
　　方法：在純化的外周NK細(xì)胞(pNK)和蛻膜NK細(xì)

14、胞(dNK)的體外培養(yǎng)體系中加入膠原蛋白分子;用shRNA轉(zhuǎn)染的滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的上清(Culture Medium，CM)培養(yǎng)NK細(xì)胞后，用免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(WesternBlot)分析LAIR-1和JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1、p-STAT1、STAT4、p-STAT4的表達(dá)，進(jìn)一步用Western Blot和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析JAK-STAT信號(hào)通路下游相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Helios等的表達(dá);用免疫

15、共沉淀技術(shù)(CoIP)分析JAK-STAT信號(hào)通路上游相關(guān)分子JAK1、JAK2和SHP-1的相互關(guān)系，以及SHP-1和LAIR-1的相互作用關(guān)系。用病毒質(zhì)粒構(gòu)建LAIR-1過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株NK-92-LAIR-1，并且通過(guò)QPCR、Western Blot和熒光顯微鏡進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步對(duì)其在活化狀態(tài)下STATs和LAIR-1的表達(dá)進(jìn)行初步分析。
　　結(jié)果：在膠原蛋白分子的刺激下，LAIR-1可以募集SHP-1，并通過(guò)后者和JAK