人蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的IL-33在誘導(dǎo)早孕母-胎免疫耐受中的作用及其細(xì)胞與分子機(jī)制.pdf

1、妊娠從免疫學(xué)上看類似于器官移植，作為同種移植物的胚胎在母體存活直至分娩，實(shí)際上反映母體對(duì)胚胎的免疫耐受，母體對(duì)胚胎的免疫排斥將導(dǎo)致妊娠失敗。揭示母-胎免疫耐受的確切機(jī)制，不僅對(duì)生殖免疫，而且對(duì)移植免疫、腫瘤免疫、自身免疫疾病都有重要意義。
　　母-胎界面主要包括蛻膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜免疫細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞，其中蛻膜基質(zhì)細(xì)胞及蛻膜免疫細(xì)胞來(lái)源于母體，而滋養(yǎng)細(xì)胞則來(lái)源于胎兒。多年來(lái)人們從不同角度研究母-胎界面發(fā)生的生物學(xué)事件，以闡述母-胎免疫

2、調(diào)節(jié)的機(jī)制，其中包括母-胎界面各組成細(xì)胞的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)，及母-胎界面Th2型免疫優(yōu)勢(shì)的形成。妊娠早期母胎界面的蛻膜被認(rèn)為是一個(gè)免疫特赦組織，妊娠早期大量白細(xì)胞在此選擇性聚集，其中最主要的是蛻膜NK細(xì)胞，約占淋巴細(xì)胞總量的70％-80％，另外還有單核巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等，這些免疫活性細(xì)胞在局部組織微環(huán)境的調(diào)控下能夠獲得特異性的表型和功能，從而決定母-胎界面免疫反應(yīng)的取向。
　　IL-33是新近發(fā)現(xiàn)的IL-1家族新成員，與受體ST2L

3、及誘餌受體sST2進(jìn)行相互調(diào)控，參與調(diào)節(jié)Th2型機(jī)體免疫，腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移等過(guò)程。此外，研究報(bào)道，IL-33/ST2信號(hào)調(diào)控異?？捎绊懽訉m內(nèi)膜容受性進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)，并且其分泌水平與流產(chǎn)及妊娠期高血壓等病理妊娠存在相關(guān)性。然而，迄今為止，IL-33在母-胎界面如何發(fā)揮作用仍不清楚。
　　第一部分 IL-33/ST2在正常妊娠早期及復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的分析IL-33/ST2在正常妊娠早期和復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患

4、者蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　方法收集早孕期正?；虿幻髟驈?fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的蛻膜組織，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)IL-33/ST2在早孕蛻膜組織中的表達(dá)。分離蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，采用ELISA、Real-time PCR及Western Blot等技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)IL-33及ST2在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，并比較IL-33及ST2表達(dá)水平在正常早孕及流產(chǎn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞之間的差別。
　　結(jié)果早孕蛻膜組織能檢測(cè)到IL-33及ST2的表達(dá)。E

5、LISA、Real-time PCR及Western Blot進(jìn)一步證實(shí)了IL-33/ST2在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，并且在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平，復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞IL-33/ST2的表達(dá)均明顯低于正常妊娠。
　　結(jié)論蛻膜組織，尤其是蛻膜基質(zhì)細(xì)胞IL-33及ST2的正常表達(dá)對(duì)妊娠的維持具有一定的作用。
　　第二部分 IL-33/ST2對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控
　　目的解析IL-33對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖及侵襲等生物

6、學(xué)行為的調(diào)節(jié)。
　　方法收集人早孕期正常的蛻膜組織，應(yīng)用胰酶消化、密度梯度離心法分離、培養(yǎng)正常人早孕期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞。不同濃度的IL-33及sST2作用48h后，分別利用BrdU細(xì)胞增殖試劑盒、Transwell實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力及細(xì)胞周期。為了驗(yàn)證IL-33對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步采用Real-time PCR檢測(cè)處理后的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中增殖相關(guān)分子(PCNA、 survivin)及侵

7、襲相關(guān)分子(titin、MMP2)的表達(dá)。
　　結(jié)果 BrdU及Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL-33以濃度依賴的方式促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖及侵襲，并且流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，IL-33處理48h后，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖指數(shù)升高。此外，Real-time PCR的結(jié)果顯示IL-33可促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖相關(guān)分子(PCNA、 survivin)及侵襲相關(guān)分子(titin、MMP2)的表達(dá)。
　　結(jié)論 IL-33可通過(guò)ST2L促進(jìn)蛻

8、膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖及侵襲。
　　第三部分 IL-33調(diào)控蛻膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能的分子機(jī)制
　　目的解析IL-33調(diào)控蛻膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能的分子機(jī)制。
　　方法分離培養(yǎng)正常人早孕期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)IL-33處理后，利用ELISA及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CCL2及CCR2的表達(dá)水平。在培養(yǎng)體系中加入anti-CCL2中和性抗體或CCR2阻滯劑(RS102895)處理后，分別利用BrdU細(xì)胞增殖試劑盒、Transwell

9、實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力及細(xì)胞周期。用IL-33處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，采用Western Blot分析信號(hào)分子NF-κB、ERK1/2、JNK及P38的磷酸化水平;在此基礎(chǔ)上，用NF-κB抑制劑BAY11-7082、ERK1/2抑制劑U0126和JNK抑制劑SP600125分別預(yù)處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞后再用IL-33處理，采用ELISA及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CCL2及CCR2的表達(dá)水平。
　　結(jié)果經(jīng)IL-3

10、3處理后，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CCL2及CCR2的表達(dá)水平增加。拮抗CCL2/CCR2的生物學(xué)作用，可下調(diào)IL-33的促增殖及促侵襲作用。WesternBlot結(jié)果顯示IL-33可引起NF-κB、ERK1/2及JNK的磷酸化水平升高，NF-κB抑制劑BAY11-7082、ERK1/2抑制劑U0126預(yù)處理細(xì)胞后，可下調(diào)IL-33引起的CCL2/CCR2升高，然而JNK抑制劑SP600125卻對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的CCL2及CCR2無(wú)上述下調(diào)作用。

11、
　　結(jié)論 IL-33可通過(guò)活化NF-κB和ERK1/2信號(hào)分子，進(jìn)而促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CCL2和CCR2的表達(dá)，并間接促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖及侵襲等生物學(xué)行為。
　　第四部分 IL-33參與調(diào)節(jié)蛻膜NK細(xì)胞的表型和功能
　　目的解析IL-33對(duì)蛻膜NK細(xì)胞表型及功能的調(diào)節(jié)作用。
　　方法利用流式細(xì)胞術(shù)分析蛻膜NK細(xì)胞ST2L的表達(dá)水平，并比較外周NK細(xì)胞與蛻膜NK細(xì)胞ST2L的表達(dá)水平。用IL-33、sST2或D

12、SCs條件培養(yǎng)液處理蛻膜NK細(xì)胞，48h后流式細(xì)胞術(shù)分析蛻膜NK細(xì)胞的表型和細(xì)胞因子的表達(dá)，細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
　　結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，蛻膜NK細(xì)胞表面表達(dá)ST2L，并且ST2L在蛻膜NK的表達(dá)水平明顯高于外周NK細(xì)胞。IL-33和DSCs條件培養(yǎng)液可顯著上調(diào)蛻膜NK細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-13)、調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子（IL-10）及促炎性細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)水平，并下調(diào)Th1型細(xì)胞因子T

13、NF-α的表達(dá)。另外，IL-33還可促進(jìn)NK表面抑制性受體KIR2DL1的表達(dá)，并下調(diào)其表面殺傷性受體NKP30和NKG2D的表達(dá)。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-33可降調(diào)節(jié)蛻膜NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，與此相一致的是經(jīng)IL-33處理后，NK細(xì)胞顆粒酶granzymeA及穿孔素perforin的表達(dá)也下降。
　　結(jié)論蛻膜基質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-33能誘導(dǎo)蛻膜NK細(xì)胞的耐受表型及Th2型優(yōu)勢(shì)，下調(diào)蛻膜NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，從而有利于形成母-胎界面

14、免疫耐受微環(huán)境。
　　第五部分 IL-33調(diào)控蛻膜NK細(xì)胞功能和表型的分子機(jī)制
　　目的解析IL-33調(diào)節(jié)蛻膜NK細(xì)胞功能和表型的下游信號(hào)通路
　　方法分離的蛻膜NK細(xì)胞經(jīng)IL-33處理后，利用Real-time PCR檢測(cè)NK分化發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。用IL-33處理蛻膜NK細(xì)胞，采用Western Blot分析信號(hào)分子NF-κB、ERK1/2、JNK及P38的磷酸化水平;在此基礎(chǔ)上，用NF-κB抑制劑BAY11-

15、7082、ERK1/2抑制劑U0126和JNK抑制劑SP600125分別預(yù)處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞后再用IL-33處理，流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞表型、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　結(jié)果經(jīng)IL-33處理后，蛻膜NK細(xì)胞Nfil3、Id2及Gata3等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增高。Western Blot結(jié)果顯示IL-33可引起NF-κB、ERK1/2及JNK的磷酸化水平升高，NF-κB抑制劑BAY11-7082預(yù)處理細(xì)胞后，可逆轉(zhuǎn)IL-33對(duì)蛻膜NK細(xì)胞表