NKp44+NK細(xì)胞促類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的分子和信號(hào)通路機(jī)制.pdf

1、目的：
　　研究NKp44+NK細(xì)胞在RA患者外周血、滑液、滑膜組織中的表達(dá)以及其與患者臨床疾病活動(dòng)度的相關(guān)性;明確NKp44+NK細(xì)胞促進(jìn)RA-FLS增殖的分子機(jī)制;闡明NKp44+NK細(xì)胞通過分泌IL-22促RA-FLS增殖的信號(hào)通路。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象
　　2012年02月至2013年12月期間，南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院中醫(yī)/風(fēng)濕科和關(guān)節(jié)骨病外科門診及病房的RA患者37例（外周血標(biāo)本，其中21例

2、患者同時(shí)捐贈(zèng)了其膝關(guān)節(jié)滑液標(biāo)本）、膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)患者16例（滑液標(biāo)本）。
　　2.疾病分類診斷標(biāo)準(zhǔn)與病情評(píng)估
　　RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)1987年修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)或美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（ACR/EULAR）2010年RA新分類標(biāo)準(zhǔn);KOA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)ACR1995年修訂的KOA分類標(biāo)準(zhǔn)。RA的病情依據(jù)DAS28和臨床疾病活動(dòng)指數(shù)（c

3、linical disease activity index，CDIA）進(jìn)行評(píng)估。
　　3.實(shí)驗(yàn)方法
　　3.1 NKp44+NK細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測及其臨床意義
　　應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測RA及其對(duì)照外周血、滑液中NKp44+NK細(xì)胞的比例，滑膜組織標(biāo)本中NKp44+NK細(xì)胞采用免疫熒光法進(jìn)行檢測。收集上述所納入RA患者、KOA患者以及健康對(duì)照人群的基本臨床信息。
　　3.2 NKp44+NK細(xì)胞流式分選、體外培

4、養(yǎng)以及上清細(xì)胞因子的檢測
　　應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別分選RA滑液中的NK細(xì)胞及NKp44+NK細(xì)胞，并用含10％ FBS+2 mM L-谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5％ C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)。收集細(xì)胞上清液之前，分別給予1×細(xì)胞刺激因子（含0.081μM PMA和1.34μM ionomycin）刺激培養(yǎng)5h。NK細(xì)胞和NKp44+NK細(xì)胞上清液IL-22和M-CSF

5、采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，RANKL應(yīng)用MILLIPLEXTM MAP Human RANKLsingle plex試劑盒進(jìn)行檢測。
　　3.3 RA-FLS體外分離培養(yǎng)和鑒定
　　應(yīng)用組織塊法分離培養(yǎng)RA-FLS，當(dāng)顯微鏡下滑膜細(xì)胞生長到培養(yǎng)瓶面積80％以上時(shí)，采用10％ FBS+100 U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5％ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行FLS傳代培養(yǎng)。分別采用免疫

6、組化法和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)第4～5代的FLS進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　3.4 細(xì)胞體外干預(yù)分組
　　①FLS增殖的細(xì)胞體外干預(yù)分組:50％ NKp44+NK細(xì)胞培養(yǎng)上清液組、50％NKp44+NK細(xì)胞培養(yǎng)上清液+50μg/ml IL-22拮抗劑組、50μg/ml IL-22拮抗劑組、1 ng/ml rhlL-22(recombinant human IL-22)組、10 ng/ml rhlL-22組、50 ng/mlrhlL-22組、1

7、00 ng/ml rhIL-22組、對(duì)照組（正常細(xì)胞培養(yǎng)液），同時(shí)各組均再分為24 h、48 h及72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的干預(yù)組。
　　②FLS信號(hào)通路蛋白研究的細(xì)胞體外干預(yù)分組:應(yīng)用50 ng/ml rhIL-22干預(yù)FLS，并干預(yù)后第0h、0.25 h、0.5 h、1h、1.5 h、2h、4h以及8h分別檢測STAT3、ERK1/2、P38總蛋白以及磷酸化蛋白的相對(duì)表達(dá)量,此外，分別用50 ng/ml rhIL-22、100μM

8、AG490、50 ng/ml rhIL-22+100μMAG490、空白對(duì)照干預(yù)FLS，除50 ng/ml rhIL-22+100μM AG490組進(jìn)一步設(shè)置干預(yù)時(shí)間亞組為0.25 h、0.5 h、1h、1.5 h、2h外，其他三組干預(yù)時(shí)間均為2h，干預(yù)結(jié)束后分別采用Western Blot檢測STAT3總蛋白以及磷酸化蛋白的相對(duì)表達(dá)量(STAT3/GAPDH，p-STAT3/STAT3)。
　?、跘G490抑制FLS增殖的細(xì)胞體

9、外干預(yù)分組:50 ng/ml rhIL-22組、50 ng/mlrhIL-22+100μM AG490組、50％ NKp44+NK細(xì)胞培養(yǎng)上清液組、50％NKp44+NK細(xì)胞培養(yǎng)上清液+100μM AG490組、100μM AG490組、對(duì)照組（正常細(xì)胞培養(yǎng)液），同時(shí)各組均再分為24 h、48 h及72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的干預(yù)組。
　　3.5 FLS細(xì)胞增殖和信號(hào)通路蛋白的檢測
　　MTT法細(xì)胞增殖檢測:取第4～5代鑒定后的FL

10、S，分別于96孔板內(nèi)接種細(xì)胞懸液3×103 cell/孔，并細(xì)胞置于37℃、5％ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中使其貼壁生長;加不同的干預(yù)措施，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至干預(yù)結(jié)束，棄培養(yǎng)基;每孔分別加入含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)基和終濃度為0.5mg/ml的MTT液，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔分別加入DMSO120μl，平板搖床低速振蕩10 min;酶標(biāo)儀測定各孔的OD值(波長490 nm)。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS20.0統(tǒng)

11、計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)描述，計(jì)數(shù)資料采用絕對(duì)數(shù)(n)及構(gòu)成比(％)描述。
　　結(jié)果：
　　1.NKp44+NK細(xì)胞在RA患者不同組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　1.1 NKp44+NK細(xì)胞在RA和對(duì)照人群外周血、滑液以及滑膜組織中的表達(dá)
　　免疫熒光檢測顯示:在RA滑膜組織中可見同時(shí)表達(dá)CD56+和NKp44+細(xì)胞表面分子的NKp44+NK細(xì)胞;然而在KOA滑膜組織中，融合處理后基本未發(fā)

12、現(xiàn)CD56+和NKp44+分子共表達(dá)的該群細(xì)胞。
　　1.2 RA外周血和滑液中NKp44+NK細(xì)胞比例與患者病情活動(dòng)相關(guān)性分析
　　滑液中NKp44+NK細(xì)胞比例與DAS28評(píng)分及CDIA評(píng)分亦均呈正相關(guān)(r=0.930，p＜0.001;r=0.904，p＜0.001)。
　　2.NKp44+NK細(xì)胞通過分泌IL-22促進(jìn)RA-FLS的增殖
　　2.1 RA-FLS體外培養(yǎng)與鑒定
　　RA-FLS體外培養(yǎng)

13、顯示:貼壁生長的FLS形態(tài)為長梭形，并呈“渦旋狀”優(yōu)勢生長。取第4～5代的FLS免疫組化鑒定顯示:絕大部分細(xì)胞呈現(xiàn)Vimentin(+)，同時(shí)細(xì)胞不表達(dá)CD68分子，細(xì)胞免疫組化染色呈陰性。此外，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行第4～5代FLS細(xì)胞表面分子CD55表達(dá)鑒定結(jié)果顯示:以同型對(duì)照進(jìn)行設(shè)門，F(xiàn)ITC-CD55(+)細(xì)胞比例可達(dá)到99％以上。
　　2.2 NK和NKp44+NK細(xì)胞流式分選、體外培養(yǎng)及細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子表達(dá)
　　

14、NK細(xì)胞培養(yǎng)上清表達(dá)更高濃度的RANKL(391.0±23.1 vs309.2±12.8 pg/ml; t=5.357，p=0.006)。
　　2.3 NKp44+NK細(xì)胞培養(yǎng)上清通過IL-22促進(jìn)RA-FLS增殖
　　正常對(duì)照組與單用50μg/ml IL-22拮抗劑干預(yù)FLS增殖程度在24 h、48 h以及72 h后差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.491，p=1.000，p=1.000)。
　　2.4 rhIL-22促R

15、A-FLS增殖呈現(xiàn)濃度依賴性
　　FLS增殖均呈濃度梯度變化趨勢，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　3.NKp44+NK細(xì)胞分泌IL-22促RA-FLS增殖信號(hào)通路機(jī)制
　　3.1 rhIL-22對(duì)RA-FLS STAT3-ERK1/2-P38總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)的影響
　　其他不同時(shí)間點(diǎn)各組p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量(p-STAT3/STAT3)均顯著升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)，

16、然而STAT3總蛋白以及內(nèi)參GAPDH蛋白的表達(dá)未見顯著差異(p＞0.05)。此外，ERK1/2和P38的總蛋白以及磷酸化蛋白表達(dá)亦均未見顯著表達(dá)差異(p＞0.05)。
　　3.2 AG490抑制rhIL-22活化RA-FLS細(xì)胞的STAT3信號(hào)通路
　　STAT3總蛋白以及內(nèi)參GAPDH蛋白的表達(dá)均未見顯著表達(dá)差異(p＞0.05)。
　　3.3 AG490抑制rhIL-22促進(jìn)的RA-FLS增殖
　　單用100

17、μM AG490干預(yù)FLS培養(yǎng)24 h、48 h以及72 h后，體外FLS的增殖程度均顯著降低，不同時(shí)間點(diǎn)兩組間相比亦均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。
　　3.4 AG490抑制NKp44+NK細(xì)胞上清促進(jìn)的RA-FLS增殖
　　單用100μM AG490干預(yù)FLS培養(yǎng)24 h、48 h以及72 h后，體外FLS的增殖程度均顯著降低，不同時(shí)間點(diǎn)兩組間相比亦均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.