雙螢光素酶共表達(dá)載體構(gòu)建及特性研究.pdf

1、研究背景：
　　 螢光素酶(luciferase)是自然界中能夠催化底物產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱,在哺乳動物體內(nèi)無內(nèi)源性表達(dá),檢測不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)影響,并且具有敏感性高,特異性好,反應(yīng)迅速,操作簡單,檢測范圍廣等優(yōu)點(diǎn),作為報告基因在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域研究已得到廣泛應(yīng)用,其中最有代表性的是螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase,Fluc)。
　　 早在1956年,Green和MeElroy就得到了螢

2、火蟲螢光素酶(Lueiferase)的結(jié)晶。螢火蟲螢光素酶是分子量為 60～64kD的多肽鏈在Mg2+、ATP、O2 存在時,催化D-螢光素(D-Luciferin)氧化脫羧,產(chǎn)生波峰在560nm左右的熒光。只有在活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目成正比。作為經(jīng)典的螢光素酶,已經(jīng)在細(xì)胞內(nèi) ATP 水平探測、感染檢測、藥物篩選、細(xì)胞標(biāo)記和示蹤以及動物活體成像等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。目前應(yīng)用最多的活體光學(xué)成像動物模型是

3、表達(dá)Fluc的動物模型。
　　 Gaussia luciferase(Gluc)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型螢光素酶,來源于海洋橈腳類動物(Gaussia princeps),其顯著特點(diǎn)是可以高效分泌至細(xì)胞外,同時具有更高的檢測靈敏度。Gluc與底物腔腸素的反應(yīng)不依賴于 ATP,結(jié)合后發(fā)出的熒光波峰在480nm左右。由于Gluc具有分子量小、易分泌、檢測靈敏度高、半衰期短等優(yōu)點(diǎn),已成功應(yīng)用于體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究中。通過檢測分泌到模型動物血

4、液或其他體液中的Gluc活性,可以定量反映動物體內(nèi)腫瘤的負(fù)荷,不僅能追蹤腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展,而且能作為有效標(biāo)記物體現(xiàn)腫瘤對治療的反應(yīng)。并且螢光素酶與特定底物的發(fā)光反應(yīng)屬于化學(xué)發(fā)光,具有特異性,不存在交叉干擾現(xiàn)象。
　　 基于上述特點(diǎn),為了結(jié)合分泌性螢光色素酶Gluc和非分泌性螢光色素酶Fluc的優(yōu)點(diǎn),本研究擬構(gòu)建一種Gluc和Fluc雙螢光色素酶共表達(dá)的報告基因載體,并對其體內(nèi)外表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行研究,為下一步建立雙螢光素酶基因標(biāo)記的腫瘤細(xì)

5、胞和動物模型、并對其進(jìn)行體內(nèi)外監(jiān)測和示蹤研究奠定基礎(chǔ)。
　　 研究目的：
　　 利用來源于 TaV的自剪切多肽 2A的編碼序列構(gòu)建一種分泌型螢光素酶Gluc 和非分泌型螢光素酶 Fluc 共表達(dá)的雙報告基因載體,對其體內(nèi)外表達(dá)及活體成像特點(diǎn)進(jìn)行研究。
　　 研究方法
　　 1.重組表達(dá)質(zhì)粒 pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc的構(gòu)建
　　 采用重疊 PCR 技術(shù)獲得 Gluc-2A-F

6、luc 基因片段,引入酶切位點(diǎn) Kpn Ⅰ和BglⅡ用于將融合片段 Gluc-2A-Fluc 定向克隆入表達(dá)質(zhì)粒 pAAV2neoCAG 中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α,挑取氨芐青霉素抗性單菌落提取質(zhì)粒,然后經(jīng)酶切鑒定正確后送公司測序鑒定。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染
　　 BHK-21 細(xì)胞在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃,5％CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞,待 BHK-21 細(xì)胞匯合度

7、達(dá)到700％～80％時,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將 pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc 轉(zhuǎn)染入 BHK-21細(xì)胞,轉(zhuǎn)染步驟按 lipofectamineTM 2000 說明書進(jìn)行。將等摩爾混合的pAAV2neoCAG-Gluc 和pAAV2neoCAG-Fluc 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染設(shè)為對照。Gluc 和Fluc在細(xì)胞水平的表達(dá)及分布特點(diǎn)研究在24孔板中進(jìn)行。Gluc 和Fluc 在細(xì)胞水平的動態(tài)監(jiān)測研究在 96孔板中進(jìn)行。
　　

8、3.收集細(xì)胞實(shí)驗(yàn)樣品
　　 轉(zhuǎn)染一定時間后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液。細(xì)胞裂解的具體步驟:將細(xì)胞用 PBS 清洗3遍,每孔加入200μl 細(xì)胞裂解緩沖液,冰上放置 30min后,將細(xì)胞懸液移入1.5 ml 離心管,12000rpm 離心 15s。收集上清液,并測量其體積。
　　 4.細(xì)胞實(shí)驗(yàn) Gluc 和Fluc 活性檢測
　　 按照試劑盒說明書檢測 Gluc 和Fluc 活性。分別取 20μl 細(xì)胞培養(yǎng)上

9、清液和細(xì)胞裂解液,加入 Gaussia luciferase Assay Kit的底物 50μl 或 Luciferase AssaySystem的底物 100μl,混勻后,用發(fā)光檢測儀(ModulusTM Luminometer)測定其相對光強(qiáng)度單位(Relative light unit,RLU),收集光子時間為 10 s,然后換算成細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞內(nèi)總 RLU。
　　 5.小鼠體內(nèi) Gluc 表達(dá)監(jiān)測

10、r>　　 6 只6～8周齡、體重為 18～20g的雄性BALB/c 小鼠隨機(jī)分為2組,每組3只小鼠。在 5～7 sec內(nèi),采用水動力注射法,實(shí)驗(yàn)組每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射 2.0ml含 10μg pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc 表達(dá)質(zhì)粒的生理鹽水,對照組每只小鼠只注射 2.0ml 生理鹽水。注射后連續(xù) 7 d 分別經(jīng)小鼠尾靜脈采取全血 2.5μl,加入Gaussia luciferase Assay Kit 中的底物,用

11、發(fā)光檢測儀(ModulusTM Luminometer)測定其相對光強(qiáng)度單位(Relative light unit,RLU)。
　　 6.小鼠活體成像
　　 質(zhì)粒 DNA 注射雄性BALB/c 小鼠體內(nèi) 12h 后,經(jīng)腹腔注射麻醉劑戊巴比妥鈉(60～80mg/kg),麻醉后,經(jīng)尾靜脈注射 300μL 含 50μg 腔腸素的PBS 溶液,立刻置于活體成像系統(tǒng)的暗箱中收集光子,每次收集光子 3min,連續(xù) 3 次。待小鼠體

12、內(nèi)不再產(chǎn)生光子后(約30min),同一只小鼠腹腔注射 D-熒光素鉀鹽(150mg/kg),注射 1min、15min、30min 后,分別用活體成像系統(tǒng)收集光子 5 sec。
　　 研究結(jié)論
　　 1.我們成功構(gòu)建了雙螢光素酶共表達(dá)載體 pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。
　　 2.體外經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
　　 共表達(dá)質(zhì)粒 pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc 能同時高效表達(dá)分泌型

13、的螢光素酶 Gluc 和非分泌型的螢光素酶 Fluc,且 Gluc 主要分布在細(xì)胞培養(yǎng)上清中,Fluc主要存在于細(xì)胞裂解液中,表明 TaV 2A 發(fā)揮了其高效的剪切功能,并未影響pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc 表達(dá)質(zhì)粒中 Gluc 和Fluc的體外表達(dá)分布特點(diǎn)。
　　 3.體內(nèi)經(jīng)水動力轉(zhuǎn)染法及活體成像驗(yàn)證
　　 TaV 2A介導(dǎo)的共表達(dá)載體pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc沒有改變Gluc

14、和Fluc在體內(nèi)的表達(dá)及分布特點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了高效剪切的功能且剪切后產(chǎn)生的多肽沒有干擾Gluc在體內(nèi)的分泌和活性。Fluc基因作為報告基因更適合于體內(nèi)成像時的表達(dá)定位研究,而Gluc由于具有高效分泌入血的特性,用于成像定位研究時有可能造成錯誤的判斷；并且注射Gluc底物后其發(fā)光信號不穩(wěn)定且發(fā)光時間短暫,也不利于成像分析。
　　 總之,本研究設(shè)計和構(gòu)建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc 共表達(dá)質(zhì)粒可以同時高效表達(dá)分泌型螢

15、光素酶 Gluc 和非分泌型螢光素酶 Fluc,既可以利用螢光素酶 Gluc的分泌特性和高靈敏度,實(shí)現(xiàn)可以在不裂解細(xì)胞或處死動物的情況下通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液或血液中 Gluc的活性來動態(tài)監(jiān)測 Gluc的表達(dá)水平；同時又可以利用螢光素酶 Fluc的細(xì)胞內(nèi)分布特點(diǎn)和發(fā)射光波長、穿透性好以及發(fā)光穩(wěn)定等特點(diǎn),發(fā)揮其在動物活體成像方面的優(yōu)勢,比單一的螢光素酶報告基因載體在細(xì)胞標(biāo)記和體內(nèi)示蹤研究方面更具優(yōu)越性。本研究為細(xì)胞及動物模型的標(biāo)記提供了一