南極磷蝦胰蛋白酶表達(dá)載體構(gòu)建與高效表達(dá).pdf_第1頁(yè)
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1、南極磷蝦屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼綱磷蝦目,這種無(wú)脊椎動(dòng)物是南極海域的關(guān)鍵物種,主要圍繞極地分布并集中于南冰洋,為多細(xì)胞生物中生物質(zhì)能最大、適應(yīng)環(huán)境最成功的動(dòng)物物種之一。
  特殊寒冷的生活環(huán)境造就了南極磷蝦體內(nèi)很多活性物質(zhì)都具有較高的研究?jī)r(jià)值,其中以胰蛋白酶的低溫高效性較為突出。南極磷蝦胰蛋白酶已經(jīng)在清除機(jī)體壞死組織、治療角膜堿燒傷以及清除牙斑等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,并且成為輕工業(yè)、食品、醫(yī)藥等學(xué)科的研究熱點(diǎn)。
  由于磷蝦樣品

2、提取胰蛋白酶的現(xiàn)實(shí)困難和相對(duì)高昂的成本,本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)將南極磷蝦胰蛋白酶基因轉(zhuǎn)入工程菌中,利用基因工程技術(shù)表達(dá)目的蛋白并初步純化,為南極磷蝦胰蛋白酶的研究提供更加深入的資料和依據(jù)。
  研究?jī)?nèi)容:
  (1)以南極磷蝦mRNA為模板,通過(guò)分析南極磷蝦胰蛋白酶基因,設(shè)計(jì)基因特異性引物,逆轉(zhuǎn)錄得到南極磷蝦胰蛋白酶cDNA。
  (2)構(gòu)建pGEX-2T-TRY(TRY代表南極磷蝦胰蛋白酶)原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)

3、胞,并經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序進(jìn)行鑒定。
  (3)將pGEX-2T-TRY轉(zhuǎn)化入工程菌E.coli BL21,優(yōu)化表達(dá)條件,以實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)。
  (4)工程菌經(jīng)超聲裂解,獲得目的蛋白。檢測(cè)目的蛋白的酶解活性并對(duì)目的蛋白初步純化。
  研究結(jié)果:
  (1)利用TAIL-PCR技術(shù)獲得基因序列,經(jīng)分析比對(duì)確認(rèn)為南極磷蝦胰蛋白酶基因,設(shè)計(jì)基因特異性引物,以南極磷蝦RNA為模板成功逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。
  (

4、2)構(gòu)建的pGEX-2T-TRY原核表達(dá)載體,經(jīng)PCR和雙酶切以及測(cè)序鑒定證明已構(gòu)建成功。
  (3)工程菌E.coli BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,成功表達(dá)出融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)在55KDa處有明顯的目的蛋白條帶,與預(yù)期的結(jié)果一致。
  (4)選用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠來(lái)純化帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白,初步純化出目的蛋白,但是尚未發(fā)現(xiàn)該蛋白具有酶活性。
  研究結(jié)論]
  本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了原核

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