肝癌靶向調(diào)控SEA-CD80基因共表達腺病毒載體的構建及抗癌免疫效應的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，在腫瘤致死率的病因中占第二位，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著人們的健康和生命。手術切除是目前治療肝癌的首選方案，但由于肝癌惡性程度高、發(fā)展迅速、容易復發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點，使肝癌總體療效不盡如人意。因此，探索新的肝癌治療方案有著重要的意義。免疫治療通過提高腫瘤細胞的免疫原性或效應細胞的效應性，激發(fā)和增強機體的免疫機能，以達到控制和殺滅腫瘤細胞的目的，是繼手術、放療、化療之后出現(xiàn)的又一腫瘤治療措施，為腫瘤的預

2、防和治療開辟了新的途徑，近年來發(fā)展十分迅速。 葡萄球菌腸毒素A(SEA)是一種強大的免疫激活劑，它無需抗原提呈細胞的加工處理，而是以完整的蛋白形式結合于MHC-Ⅱ類分子溝槽外側(cè)，激活大量的T細胞，同時產(chǎn)生大量的細胞因子，如TNF-α、IL-2、IFN-γ等，從而產(chǎn)生抗腫瘤效應。為了降低SEA在腫瘤治療中對正常MHC-Ⅱ+細胞的毒副作用，本室首次構建了膜表達型SEA基因，使SEA表達在腫瘤細胞表面，目的是使其誘導的免疫反應局限在腫

3、瘤局部。SEA誘導的T細胞活化需要TCR和CD28介導的活化信號的共同參與。而CD80是能夠與CD28分子結合的共刺激分子之一，它與T細胞表面CD28分子的結合為T細胞有效活化提供第二信號。腫瘤治療的靶向性問題一直為人們所關注，其中利用腫瘤特異性調(diào)控元件調(diào)控目的基因的表達是實現(xiàn)腫瘤靶向治療的途徑之一。本研究的目的是利用本室已構建的膜表達型SEA基因，構建肝癌特異性AFP基因調(diào)控元件調(diào)控的SEA/CD80基因共表達重組腺病毒載體，通過瘤內(nèi)

4、注射方式感染腫瘤細胞，導入SEA和CD80基因，以提高腫瘤細胞的免疫原性，并提供有效誘導T細胞活化的共刺激分子，以誘導機體的抗腫瘤免疫應答，對肝癌進行靶向免疫基因治療，觀察其抗癌效應并對其抗癌免疫機理進行初步研究。 1.小鼠甲胎蛋白基因順式調(diào)控元件的選擇性克隆重組及功能研究目的：構建并選擇高效的肝癌特異性甲胎蛋白(AFP)基因調(diào)控元件。方法：提取小鼠肝臟DNA，采用PCR方法克隆AFP基因增強子Ⅰ、抑制子和啟動子，經(jīng)過不同組合構

5、建兩個真核表達載體：pEGFP-1-EP(含AFP調(diào)控序列Ⅰ：增強子Ⅰ+啟動子)和pEGFP-1-ERP(含AFP調(diào)控序列Ⅱ：增強子Ⅰ+抑制子+啟動子)；采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細胞株Hepa1-6、黑色素瘤細胞株B16和成纖維細胞株NIH3T3，培養(yǎng)48h后，采用熒光顯微鏡觀察和流式細胞術檢測EGFP在上述轉(zhuǎn)染細胞中的表達情況，以判斷AFP調(diào)控序列Ⅰ和Ⅱ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性及特異性，從中選擇高效的肝癌

6、特異性AFP調(diào)控序列。結果：所得AFP基因增強子Ⅰ、抑制子和啟動子序列與Genebank中公布的相關序列一致；熒光顯微鏡下：pEGFP-1-EP和pEGFP-1-ERP轉(zhuǎn)染Hepa1-6細胞呈強陽性反應，pEGFP-1(空載體)轉(zhuǎn)染Hepa1-6和三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的B16、NIH3T3細胞均呈陰性反應；流式細胞術檢測結果顯示：pEGFP-1-EP轉(zhuǎn)染Hepa1-6陽性細胞率和平均熒光強度高于pEGFP-1-ERP轉(zhuǎn)染Hepa1-6細胞，兩者

7、陽性細胞率和平均熒光強度均高于pEGFP-1轉(zhuǎn)染Hepa1-6細胞；pEGFP-1轉(zhuǎn)染Hepa1-6和三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16、NIH3T3陽性細胞率和平均熒光強度均較低。結論：我們所構建小鼠AFP基因調(diào)控序列Ⅰ和調(diào)控序列Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性均具有肝癌特異性，且前者高于后者。我們選擇調(diào)控序列Ⅰ作為下一步肝癌特異性基因治療中使用。 2.SEA/CD80基因共表達重組腺病毒載體的構建及體外感染肝癌細胞的研究目的：構建肝癌靶向調(diào)控SEA、CD80

8、基因重組腺病毒載體和SEA/CD80基因共表達重組腺病毒載體，了解其感染Hepa1-6細胞后SEA/CD80的表達情況及體外誘導淋巴細胞增殖活性。方法：首先利用現(xiàn)有的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle和pShuttle-CMV，構建新的不帶CMV增強子/啟動子而帶有polyA加尾信號穿梭質(zhì)粒，命名為pShuttle2。采用PCR方法從已構建載體pLXSN-SEP亞克隆跨膜型SEA(SEAtm)基因，采用RT-PCR方法從小鼠脾臟克隆CD80

9、基因，中間通過內(nèi)部核糖體進入位點(Internalribosomeentrysite，IRES)序列的連接將SEAtm和CD80克隆至pMD18-T-BIS，將AFP增強子、啟動子、SEA及CD80基因分別從已構建的pKS-EP載體和pMD18-T-BIS載體上，分別亞克隆至pShuttle2載體，再與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化E.coliBJ5183。以獲得的重組子轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，分別制備空載體腺病毒Ad-empt

10、y和重組腺病毒Ad-AFP-SEA(SEA)、Ad-AFP-CD80(CD80)、Ad-AFP-BIS(SEA/CD80)，然后分別感染Hepa1-6、NIH3T3和B16細胞。采用間接免疫熒光法，激光共聚焦顯微鏡觀察和流式細胞術檢測SEA和CD80在細胞膜表面的表達情況；對Hepa1-6細胞以MOI為100的量感染腺病毒，采用MTT法觀察腺病毒對Hepa1-6細胞生長的影響；采用3H摻入法檢測Hepa1-6細胞感染腺病毒后體外誘導淋巴

11、細胞增殖的活性。結果：成功制備了重組腺病毒Ad-AFP-SEA、Ad-AFP-CD80和Ad-AFP-BIS(SEA/CD80)；以制備的重組腺病毒感染Hepa1-6細胞后，流式細胞術檢測顯示SEA和CD80能夠在Hepa1-6細胞膜上表達，而在NIH3T3和B16細胞中不表達；激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，SEA和CD80能夠在Hepa1-6細胞膜上共表達；腺病毒本身對Hepa1-6細胞的生長無影響；誘導淋巴細胞增殖結果顯示：Hepa1-

12、6細胞感染Ad-AFP-BIS后對淋巴細胞增殖的誘導能力最強，Hepa1-6細胞感染Ad-AFP-SEA和Ad-AFP-CD80后對淋巴細胞增殖的誘導能力高于感染Ad-empty和未感染細胞。Ad-AFP-SEA和Ad-AFP-CD80感染的Hepa1-6細胞之間、Ad-empty和未感染的Hepa1-6細胞之間無明顯差異。結論：構建了肝癌靶向調(diào)控的SEA、CD80基因重組腺病毒載體和SEA/CD80基因共表達重組腺病毒載體；腺病毒能夠

13、介導SEA/CD80在Hepa1-6細胞膜上的表達，且體外能夠誘導淋巴細胞的增殖；對細胞的生長無直接毒性作用。為進一步研究SEA和CD80在肝癌靶向免疫基因治療中的聯(lián)合應用及其抗癌免疫機制奠定了基礎。 3.SEA/CD80基因共表達重組腺病毒抗肝癌免疫效應的研究目的：檢測SEA/CD80基因共表達重組腺病毒的體內(nèi)免疫學效應，及對肝癌的治療作用。方法：通過瘤體內(nèi)注射重組腺病毒的方式，對肝癌進行免疫基因治療。采用RT-PCR和Wes

14、ternblot方法檢測注射重組腺病毒后的腫瘤組織和正常肝臟組織表達SEA和CD80的情況；采用ELISpot方法和LDH釋放實驗分別檢測脾臟淋巴細胞中腫瘤特異性IFN-γ分泌細胞的頻數(shù)和細胞毒性T細胞(CTLs)殺傷活性；觀察重組腺病毒對腫瘤的治療作用。結果：注射重組腺病毒后，SEA和CD80能夠有效地在腫瘤組織中表達，在正常肝臟組織中不表達；與SEA組、CD80組比較，SEA/CD80組脾淋巴細胞中分泌IFN-γ的T細胞數(shù)量明顯增多

15、(P＜0.01)，CTL對Hepa1-6細胞的特異性殺傷作用明顯增強(P＜0.01)；在腫瘤治療實驗中，SEA/CD80組腫瘤體積明顯小于其它組(P＜0.01)，荷瘤小鼠生存期顯著大于其它組(P＜0.01)。結論：腺病毒介導的SEA/CD80聯(lián)合免疫基因治療能夠刺激機體產(chǎn)生腫瘤特異性的細胞免疫，對肝癌有良好的治療作用。 本研究成功地從小鼠肝臟克隆了AFP增強子Ⅰ、抑制子和啟動子，經(jīng)組合后形成兩個調(diào)控序列：①AFP增強子Ⅰ+啟動子

16、(EP)，②AFP增強子Ⅰ+抑制子+啟動子(ERP)，并對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性進行了比較，結果顯示兩個調(diào)控序列對外源基因的表達調(diào)控都具有肝癌特異性，但EP轉(zhuǎn)錄活性高于ERP；成功地從小鼠脾臟克隆了CD80基因，并對本室首次構建的跨膜型SEA(SEAtm)進行了亞克隆，利用現(xiàn)有的穿梭質(zhì)粒pShuttle和pShuttle-CMV構建了新的多克隆位點上游不帶啟動子，下游帶有SV40polyA加尾信號的穿梭質(zhì)粒，采用AdEasyTM腺病毒制備系統(tǒng)，

17、通過SEA和CD80基因中間插入IRES元件首次構建了肝癌靶向性SEA/CD80共表達重組腺病毒載體Ad-AFP-BIS；體內(nèi)外實驗證實Ad-AFP-BIS感染腫瘤細胞后，能夠使腫瘤細胞有效地共表達CD80和跨膜型SEA，且體外能夠誘導脾淋巴細胞的增殖，體內(nèi)能夠誘導機體產(chǎn)生肝癌特異性細胞免疫反應；荷瘤小鼠經(jīng)瘤內(nèi)注射重組腺病毒Ad-AFP-BIS治療后，能抑制Hepa1-6肝癌的生長，提高荷瘤小鼠的生存率，延長生存期。本研究為肝癌的靶向免