四環(huán)素誘導(dǎo)的Cre重組酶表達(dá)載體的構(gòu)建及其體外表達(dá)研究.pdf

1、Cre/loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的條件性基因敲除(conditional gene knockout)克服了傳統(tǒng)基因敲除的諸多弊端，是基因功能研究的最重要的技術(shù)之一。在此基礎(chǔ)上，Cre/loxP系統(tǒng)與Tet基因表達(dá)系統(tǒng)相結(jié)合建立起的誘導(dǎo)性條件性基因敲除技術(shù)，能夠更精確地研究基因的功能。該技術(shù)需要制備兩種遺傳工程小鼠，一種是時間特異性可誘導(dǎo)表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠，另一種是目的基因片段兩側(cè)帶有同向loxP位點(diǎn)的基因打靶小鼠，通過兩種鼠系的雜交，可實(shí)

2、現(xiàn)可誘導(dǎo)性的時間特異性的基因敲除。 本研究構(gòu)建和鑒定了兩個誘導(dǎo)表達(dá)Cre的真核表達(dá)載體，并對這兩個載體的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了初步研究，為建立誘導(dǎo)性表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠及進(jìn)一步制備條件性ADAM10基因敲除的小鼠奠定了基礎(chǔ)，有助于開展ADAM10基因功能的研究。 采用分子生物學(xué)技術(shù)，將Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)的pTRE載體線性化，并與pCre-IRES-EGFP質(zhì)粒中長約2.7kb的片段連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pTRE-Cre-E

3、GFP(P1)。將P1與Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)中的另一載體pTet-On共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，加入或者不加強(qiáng)力霉素(Doxycycline，Dox)，觀察綠色熒光和Cre重組酶基因的表達(dá)。切下P1載體的部分片段Phcmv-Cre-EGFP與pTet-On載體的部分片段Pcmv-rtTA連接成Pcmv-rtTA-EGFP-Cre-Phcmv(P2)載體，將其轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，加入或者不加Dox誘導(dǎo)，對照觀察綠色熒光和Cre重組酶基因的表

4、達(dá)。P1與pTet-On的共轉(zhuǎn)染及P2載體的單轉(zhuǎn)染均以pCre-IRES-EGFP為陽性對照組，分別對誘導(dǎo)表達(dá)出的Cre重組酶基因進(jìn)行RT-PCR鑒定。 結(jié)果顯示，經(jīng)酶切和測序鑒定，成功構(gòu)建了P1和P2載體。采用脂質(zhì)體LP2000將P1與pTet-On質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，不加Dox時，沒有或者很少表達(dá)綠色熒光；陽性對照組表達(dá)綠色熒光。而加入Dox后，P1與pTet-On質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)出綠色熒光：轉(zhuǎn)染48小時后，分

5、別提取其RNA，經(jīng)RT-PCR檢測表明，誘導(dǎo)表達(dá)出綠色熒光的細(xì)胞，均能檢測出Cre基因的表達(dá)；反之，則檢測不出Cre基因的表達(dá)，證實(shí)了綠色熒光和Cre基因的表達(dá)是一致的。 采用LP2000將P2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，不加Dox時，沒有綠色熒光的表達(dá)，陽性對照組表達(dá)綠色熒光，而加入Dox后，P2的轉(zhuǎn)染能誘導(dǎo)表達(dá)綠色熒光；轉(zhuǎn)染48小時后分別提取其RNA進(jìn)行RT-PCR檢測，誘導(dǎo)表達(dá)出綠色熒光時均能從mRNA水平上檢測出Cre基因的表達(dá)

6、；反之，則檢測不出Cre基因的表達(dá)。 綜上所述，得出以下結(jié)論： 本研究成功構(gòu)建并鑒定了誘導(dǎo)性表達(dá)Cre重組酶的載體(P1和P2)。P1和pTet-On質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染能在293T細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)綠色熒光，并能從mRNA水平上檢測出Cre基因的表達(dá)。P2的轉(zhuǎn)染也能在293T細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)綠色熒光，并能從mRNA水平上檢測出Cre基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本研究所構(gòu)建的誘導(dǎo)性表達(dá)Cre的載體P1和P2均能以時間特異性的方式誘導(dǎo)表達(dá)