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文檔簡介
1、研究目的:
利用基因表達譜芯片技術確定結直腸癌患者外周血基因表達變化,篩選外周血中與結直腸癌患者預后相關的基因,利用熒光定量PCR技術對候選基因進一步驗證,初步探索利用外周血基因表達變化建立結直腸癌的多基因預后模型的可行性。
研究方法:
第一部分:
用PAXgene管分別收集初次就診的結直腸癌患者術前的外周血樣本以及健康志愿者外周全血樣本各20例,利用Human Genome GeneChip p
2、lus U1332.0Array(Affymetrix)全基因組表達譜芯片檢測RNA的表達。采用SignificanceAnalysis of Microarrays(SAM)篩選差異基因;利用DAVID BioinformaticsResources6.7在線行Panther通路分析和GO生物學功能分析;利用熒光定量PCR技術進行驗證,并用One-way ANOVA和Newman-Keuls Multiple Comparison T
3、est雙側檢驗,驗證芯片實驗結果。
第二部分:
用PAXgene管收集已經(jīng)確診為結直腸癌患者的治療前外周全血樣本,同時進行臨床數(shù)據(jù)的搜集和隨訪。利用Human Genome GeneChip plus U1332.0Array(Affymetrix)全基因組表達譜芯片檢測結直腸癌患者外周血基因表達水平,采用Significance Analysis of Microarrays(SAM)篩選預后相關基因;利用DAVI
4、DBioinformatics Resources6.7在線行Panther通路分析和GO生物學功能分析。
第三部分:
利用實時熒光定量PCR技術平臺,選取與大腸癌預后相關性最高的前31個基因,在226例結直腸癌外周血樣本中進一步驗證,采用COX回歸分析中的“逐步引入-剔除”方法,從候選基因中篩選出最佳組合的基因,初步建立結直腸癌預后模型;應用Kaplan-Meier法評估生存率,應用log-rank檢驗評價不同組間
5、生存率的差別。
研究結果:
第一部分:
通過對外周血全基因組表達譜芯片結果統(tǒng)計分析,我們得到1469個基因在結直腸癌患者和健康志愿者外周血中差異表達。基因特征及功能聚類分析顯示這些差異表達基因主要是與免疫功能相關。Panther通路分析分析得出差異表達基因主要與22個明確的基因通路密切相關。其中,特定免疫功能相關的通路顯示出很高的相關性,包括B細胞的激活,T細胞的激活,干擾素-γ信號通路,白介素信號通路。此
6、外,一些與血管生成相關的通路,例如PDGF、VEGF和FGF信號通路,也在腫瘤患者外周血中呈現(xiàn)出過度表達水平。GO分析顯示差異表達基因主要與74個生物學反應過程增強相關,包括固有免疫應答、信號轉導、蛋白質運輸、凋亡過程、蛋白磷酸化以及病毒復制。其中,在結直腸癌患者的外周血中,與Toll-Like Receptor通路相關的一系列基因表達顯著上調。
第二部分:
外周血全基因組表達譜芯片結果統(tǒng)計分析顯示,968個基因與預
7、后相關(FDR<0.01),其中風險基因773個,保護基因195個?;蛱卣骷肮δ芫垲惙治鲲@示這些差異表達基因主要是與免疫功能相關。對968個預后相關基因的Panther通路分析顯示特征基因主要涉及了Toll-Like Receptor通路、FGF信號通路、趨化因子和細胞因子介導的炎癥信號通路、T細胞的激活。其中,9個與Toll-LikeReceptor通路相關的基因全部為預后風險基因,13個與T細胞激活通路相關的基因中有9個為預后保護
8、基因和4個預后風險基因。GO分析顯示與結直腸癌預后相關的主要涉及到的生物學過程有免疫反應、免疫反應過程的調節(jié)、損傷應答、炎癥反應等相關。其中,風險基因涉及的損傷應答和保護基因涉及的T細胞活化及調節(jié)是影響預后的重要生物學過程。
第三部分:
我們得到由SRA1、RCAN3、HP、BST1和MGST1這5個特征基因組成的結直腸癌預后模型,生存分析顯示,該預測模型在Ⅱ期結直腸癌患者中具有較好的預測潛能,但是在Ⅲ期患者中沒有顯
9、示出明顯的意義。
結論:
1.結直腸癌患者外周血基因表達譜發(fā)生特征性的變化,使我們對結直腸癌外周血基因表達特征的改變有了新的理解。為今后利用外周血基因表達譜的改變發(fā)展結直腸癌診斷與預后的標志物提供了基礎。
2.應用Affymetrix全基因組表達譜芯片對CRC患者外周血基因情況表達分析,可以初步篩選預后相關基因,為后續(xù)研究提供研究基礎。
3.研究顯示Toll-Like Receptor通路和T細胞
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