結(jié)直腸癌患者外周血基因表達(dá)譜的預(yù)后價(jià)值研究.pdf

1、研究目的:
　　利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)確定結(jié)直腸癌患者外周血基因表達(dá)變化，篩選外周血中與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)的基因，利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)候選基因進(jìn)一步驗(yàn)證，初步探索利用外周血基因表達(dá)變化建立結(jié)直腸癌的多基因預(yù)后模型的可行性。
　　研究方法:
　　第一部分:
　　用PAXgene管分別收集初次就診的結(jié)直腸癌患者術(shù)前的外周血樣本以及健康志愿者外周全血樣本各20例，利用Human Genome GeneChip p

2、lus U1332.0Array(Affymetrix)全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)RNA的表達(dá)。采用SignificanceAnalysis of Microarrays(SAM)篩選差異基因;利用DAVID BioinformaticsResources6.7在線(xiàn)行Panther通路分析和GO生物學(xué)功能分析;利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，并用One-way ANOVA和Newman-Keuls Multiple Comparison T

3、est雙側(cè)檢驗(yàn)，驗(yàn)證芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　第二部分:
　　用PAXgene管收集已經(jīng)確診為結(jié)直腸癌患者的治療前外周全血樣本，同時(shí)進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)的搜集和隨訪。利用Human Genome GeneChip plus U1332.0Array(Affymetrix)全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血基因表達(dá)水平，采用Significance Analysis of Microarrays(SAM)篩選預(yù)后相關(guān)基因;利用DAVI

4、DBioinformatics Resources6.7在線(xiàn)行Panther通路分析和GO生物學(xué)功能分析。
　　第三部分:
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)平臺(tái)，選取與大腸癌預(yù)后相關(guān)性最高的前31個(gè)基因，在226例結(jié)直腸癌外周血樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證，采用COX回歸分析中的“逐步引入-剔除”方法，從候選基因中篩選出最佳組合的基因，初步建立結(jié)直腸癌預(yù)后模型;應(yīng)用Kaplan-Meier法評(píng)估生存率，應(yīng)用log-rank檢驗(yàn)評(píng)價(jià)不同組間

5、生存率的差別。
　　研究結(jié)果:
　　第一部分:
　　通過(guò)對(duì)外周血全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，我們得到1469個(gè)基因在結(jié)直腸癌患者和健康志愿者外周血中差異表達(dá)。基因特征及功能聚類(lèi)分析顯示這些差異表達(dá)基因主要是與免疫功能相關(guān)。Panther通路分析分析得出差異表達(dá)基因主要與22個(gè)明確的基因通路密切相關(guān)。其中，特定免疫功能相關(guān)的通路顯示出很高的相關(guān)性，包括B細(xì)胞的激活，T細(xì)胞的激活，干擾素-γ信號(hào)通路，白介素信號(hào)通路。此

6、外，一些與血管生成相關(guān)的通路，例如PDGF、VEGF和FGF信號(hào)通路，也在腫瘤患者外周血中呈現(xiàn)出過(guò)度表達(dá)水平。GO分析顯示差異表達(dá)基因主要與74個(gè)生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程增強(qiáng)相關(guān)，包括固有免疫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、凋亡過(guò)程、蛋白磷酸化以及病毒復(fù)制。其中，在結(jié)直腸癌患者的外周血中，與Toll-Like Receptor通路相關(guān)的一系列基因表達(dá)顯著上調(diào)。
　　第二部分:
　　外周血全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析顯示，968個(gè)基因與預(yù)

7、后相關(guān)(FDR＜0.01)，其中風(fēng)險(xiǎn)基因773個(gè)，保護(hù)基因195個(gè)?；蛱卣骷肮δ芫垲?lèi)分析顯示這些差異表達(dá)基因主要是與免疫功能相關(guān)。對(duì)968個(gè)預(yù)后相關(guān)基因的Panther通路分析顯示特征基因主要涉及了Toll-Like Receptor通路、FGF信號(hào)通路、趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路、T細(xì)胞的激活。其中，9個(gè)與Toll-LikeReceptor通路相關(guān)的基因全部為預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)基因，13個(gè)與T細(xì)胞激活通路相關(guān)的基因中有9個(gè)為預(yù)后保護(hù)

8、基因和4個(gè)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)基因。GO分析顯示與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的主要涉及到的生物學(xué)過(guò)程有免疫反應(yīng)、免疫反應(yīng)過(guò)程的調(diào)節(jié)、損傷應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等相關(guān)。其中，風(fēng)險(xiǎn)基因涉及的損傷應(yīng)答和保護(hù)基因涉及的T細(xì)胞活化及調(diào)節(jié)是影響預(yù)后的重要生物學(xué)過(guò)程。
　　第三部分:
　　我們得到由SRA1、RCAN3、HP、BST1和MGST1這5個(gè)特征基因組成的結(jié)直腸癌預(yù)后模型，生存分析顯示，該預(yù)測(cè)模型在Ⅱ期結(jié)直腸癌患者中具有較好的預(yù)測(cè)潛能，但是在Ⅲ期患者中沒(méi)有顯

9、示出明顯的意義。
　　結(jié)論:
　　1.結(jié)直腸癌患者外周血基因表達(dá)譜發(fā)生特征性的變化，使我們對(duì)結(jié)直腸癌外周血基因表達(dá)特征的改變有了新的理解。為今后利用外周血基因表達(dá)譜的改變發(fā)展結(jié)直腸癌診斷與預(yù)后的標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)。
　　2.應(yīng)用Affymetrix全基因組表達(dá)譜芯片對(duì)CRC患者外周血基因情況表達(dá)分析，可以初步篩選預(yù)后相關(guān)基因，為后續(xù)研究提供研究基礎(chǔ)。
　　3.研究顯示Toll-Like Receptor通路和T細(xì)胞