Ran在結(jié)直腸癌中的表達(dá)模式、預(yù)后價值及功能研究.pdf

1、【背景】
　　結(jié)直腸癌（colorectalcancer，CRC）無論在世界范圍內(nèi)還是在中國，均是最常見的惡性腫瘤之一。目前的主要治療手段有新輔助化放療、外科手術(shù)治療及姑息性治療等。盡管近些年醫(yī)學(xué)界在結(jié)直腸癌的早期診斷、放射性治療、化療、根治術(shù)式等方面取得了一定進展，但CRC患者的總體5年生存率并沒有得到顯著提高。因此迫切需要尋找新的腫瘤分子標(biāo)志物并經(jīng)過臨床研究得到驗證和轉(zhuǎn)化，對于闡明結(jié)直腸癌的發(fā)病機制、改善CRC患者的生存質(zhì)量和

2、預(yù)后具有重要意義。
　　Ran（Ras-relatednuclear）也稱為TC4，最初是作為人類cDNA的一個可譯框而被發(fā)現(xiàn)，并首先從人類畸胎瘤細(xì)胞系中分離純化得到的一種蛋白質(zhì)。Ran在真核細(xì)胞的一系列生物過程中，如DNA的復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄和加工、有絲分裂和減數(shù)分裂的控制，尤其是紡錘體的組裝、染色體的正確分配、核膜的破裂和重組及紡錘體檢查點的調(diào)節(jié)等方面，都有一定的作用。但Ran最廣為人知的是其在DNA復(fù)制以及核漿轉(zhuǎn)運RNA和蛋

3、白質(zhì)方面中的作用。這些在機制方面的研究說明Ran可能作為一個重要的癌基因參與腫瘤惡性生物學(xué)行為。在腎透明細(xì)胞癌中，高表達(dá)的Ran預(yù)示著預(yù)后不良。在卵巢癌中Ran表達(dá)水平增高并且與細(xì)胞的有絲分裂密切相關(guān)。在其他腫瘤如肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胰腺癌中只是限于細(xì)胞水平上研究。目前有關(guān)Ran在結(jié)直腸癌中的表達(dá)模式及分子水平上的作用研究尚未見報道。
　　【目的】
　　1.檢測Ran在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)和意義。<

4、br>　　2.探討Ran的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。
　　3.觀察Ran對結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖能力的影響。
　　【方法】
　　1.免疫組織化學(xué)和Westernblot法檢測Ran在結(jié)直腸癌組織及其對應(yīng)正常組織中的表達(dá)水平。
　　2.利用免疫共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察Ran的亞細(xì)胞定位情況。
　　3.統(tǒng)計方法分析Ran的表達(dá)與臨床病理資料之間的關(guān)系。
　　4.通過隨訪資料，利用Kaplan-Me

5、ier法和Cox’s比例風(fēng)險回歸模型分析篩選影響CRC患者總生存時間的相關(guān)因素。
　　5.將Ran特異性siRNA轉(zhuǎn)染入結(jié)直腸癌細(xì)胞，獲得瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞系。Westernblot方法篩選具有最佳干擾效果的siRNA。
　　6.構(gòu)建慢病毒，穩(wěn)定下調(diào)Ran的表達(dá)。
　　7.利用MTT實驗、平板集落形成實驗、流式細(xì)胞術(shù)等觀察Ran對轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外生長增殖能力的影響。裸鼠成瘤實驗觀察下調(diào)Ran的表達(dá)后對結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。

6、
　　【結(jié)果】
　　1.在287例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中，Ran的表達(dá)陽性率為91.29％。其中25例組織表達(dá)為陰性（-），76例表達(dá)為弱陽性（+），118例表達(dá)為中等陽性（++），68例表達(dá)為強陽性（+++）。Ran的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的分化程度（P=0.005）、侵襲深度（P=0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.001）明顯相關(guān)，此外并未發(fā)現(xiàn)Ran的表達(dá)水平與患者的年齡、性別存在相關(guān)性（P值分別為0

7、.984和0.592）。Westernblot實驗發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW480、SW620、LoVo、HT-29）總蛋白中Ran表達(dá)未見差異。但是提取上述各細(xì)胞系的核蛋白發(fā)現(xiàn)，Ran在SW620和HT-29中表達(dá)最高，在LoVo中表達(dá)很弱或幾乎不表達(dá)。
　　2.共聚焦結(jié)果顯示，Ran在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均有表達(dá)，但主要位于細(xì)胞核中。其中在細(xì)胞核表達(dá)水平上又以SW620和HT-29中表達(dá)最高，LoVo幾乎不表達(dá)。這一結(jié)果與上述We

8、sternblot結(jié)果相符合。
　　3.Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，隨Ran表達(dá)水平的增高，結(jié)直腸癌患者的總生存時間縮短（log-rank檢驗：P＜0.001）。CRC患者術(shù)后的平均及中位生存時間為33.664±1.073個月和28個月。在287例CRC患者中，Ran陰性表達(dá)組的術(shù)后平均生存時間為52.280±2.855個月，Ran表達(dá)為弱陽性組、中度陽性組和強陽性組的術(shù)后平均生存時間分別為38.623±1.736個月、31

9、.335±1.440個月和21.245±1.073個月。單變量分析顯示Ran的表達(dá)水平、分化程度及臨床病理分期與CRC患者的總生存時間顯著相關(guān)。將單因素分析篩選的相關(guān)因素納入到Cox’s風(fēng)險比例回歸模型分析中。以校正后的Ran表達(dá)陰性組（-）HR=1.0為參考值，弱陽性組（+）、中度陽性組（++）和強陽性組（+++）的HR值分別為1.724（P=0.161）、2.475（P=0.018）和5.374（P＜0.001）。單因素和多因素生存

10、分析發(fā)現(xiàn)，Ran的表達(dá)水平可以作為影響CRC患者預(yù)后的獨立危險因素。
　　4.在構(gòu)建的3個Ran特異性干擾RNA中，Westernblot結(jié)果提示siRNA-1干擾效果最佳，且在轉(zhuǎn)染后第48小時的效果最明顯。
　　5.在表達(dá)下調(diào)Ran的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功后，體外結(jié)果提示轉(zhuǎn)染目的病毒的SW620細(xì)胞較對照組相比，生長速度顯著減慢，單細(xì)胞集落形成能力減弱，G1期進入S期的細(xì)胞比例顯著降低。將轉(zhuǎn)染慢病毒的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系皮下注射裸鼠一個