細(xì)菌群體感應(yīng)蛋白QseC抑制劑Br-LED209抗菌作用機(jī)理的初步研究.pdf

1、目的:
　　耐藥細(xì)菌感染是臨床抗感染治療中極為棘手的問題,也是造成重癥感染死亡的首要原因,已成為各國(guó)政府高度關(guān)注的社會(huì)公共健康問題。目前,抗生素仍是臨床治療細(xì)菌感染性疾病的一線藥物。然而,幾乎所有抗生素在應(yīng)用過程中都會(huì)不可避免地誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥。因此,新型抗生素的研制并不能從根本上解決細(xì)菌耐藥問題,尋找和研制不誘導(dǎo)耐藥的新型抗菌藥物成為當(dāng)今抗菌藥物研發(fā)領(lǐng)域的最新熱點(diǎn),代表著未來新型抗菌藥物研發(fā)的新方向。
　　群體感應(yīng)系統(tǒng)(quo

2、rum sensing system,QSS)是廣泛存在于細(xì)菌內(nèi)的一種群體行為調(diào)控系統(tǒng),其中QseC是廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中的QSS,它參與調(diào)控多種致病毒力基因的表達(dá),與革蘭氏陰性菌毒力、侵襲力和致病性密切相關(guān)。業(yè)已證實(shí),抑制細(xì)菌QseC可以顯著抑制多種毒力因子的表達(dá),降低細(xì)菌的致病性,但不影響細(xì)菌的生長(zhǎng),因而不會(huì)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)造成選擇性壓力,具有不易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。因此,以QseC為靶點(diǎn)的不易誘導(dǎo)耐藥的新型抗菌藥物已成為研究的

3、新趨勢(shì)和新熱點(diǎn)。然而,目前已知所有作用于QseC的抑制劑在體外均無抑菌或殺菌作用,僅在感染動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出抗菌作用。迄今為止,這一現(xiàn)象的內(nèi)在規(guī)律和機(jī)制幾乎完全不清楚。本研究旨在探討QseC抑制劑體內(nèi)抗菌作用可能的機(jī)理,為深入認(rèn)識(shí)QseC抑制劑的體內(nèi)抗菌規(guī)律提供重要的研究線索,為通過抑制細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的抗菌策略探索新路徑。
　　方法:
　　1.QseC選擇性抑制劑Br-LED209的合成與表征:以對(duì)乙酰胺基苯磺酰氯和對(duì)溴苯胺為

4、起始反應(yīng)物,分別通過?；磻?yīng)和去酰化反應(yīng)脫保護(hù)得到4-氨基-N-(4-溴苯基)苯磺酰胺,最后與異硫氰酸苯酯硫脲化得到N-(4-溴苯基)-4-(3-苯基硫脲基)苯磺酰胺,即Br-LED209,產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜(MS)、核磁共振氫譜(1H NMR)和核磁共振碳譜(13C NMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　2.Br-LED209對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響:使用微量稀釋法測(cè)定 Br-LED209對(duì)鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuri

5、um)、腸出血性大腸埃希菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)、福氏志賀菌(Shigella flexneri)的最低抑菌濃度（MIC)。使用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀定時(shí)測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光度(OD600),觀察Br-LED209在10μM、50μM和200μM濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響,以左氧氟沙星作為陽性對(duì)照藥,繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。
　　3.Br-LED209在鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠體內(nèi)

6、抗菌作用:BALB/c小鼠腹腔注射約1.0×108 CFU鼠傷寒沙門氏菌,制備小鼠膿毒癥模型。于感染前、感染后3小時(shí)分別灌胃給予Br-LED20920 mg/kg,感染后24小時(shí),脫頸處死小鼠,獲取肝臟、脾臟、肺臟和腎臟進(jìn)行勻漿,勻漿液10倍梯度稀釋后均勻涂布于瓊脂平板,計(jì)數(shù)感染小鼠肝臟、脾臟、肺臟和腎臟細(xì)菌CFU,評(píng)價(jià)Br-LED209對(duì)感染小鼠臟器荷菌量的影響。制備感染小鼠肝臟、脾臟病理切片,進(jìn)行HE染色,評(píng)價(jià)Br-LED209對(duì)感

7、染小鼠臟器的保護(hù)作用。
　　4.Br-LED209對(duì)鼠傷寒沙門氏菌毒力基因表達(dá)影響:鼠傷寒沙門氏菌在200μΜBr-LED209作用下培養(yǎng)12小時(shí)后,吸取各組菌液1 mL加入1.5 mL EP管中,4℃,12000 rpm離心2分鐘收集菌體沉淀。按照天根試劑盒說明書操作提取細(xì)菌總RNA,反轉(zhuǎn)錄后采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Br-LED209對(duì)受QseC群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的下游重要致病毒力因子flhDC、sifA和sopB基因表達(dá)的影響

8、,確證Br-LED209是否能阻斷鼠傷寒沙門氏菌QseC群體感應(yīng)系統(tǒng)。
　　5.Br-LED209抗菌作用機(jī)理的初步探討:①將鼠傷寒沙門氏菌穿刺接種于含0.3％瓊脂粉的半固體LB培養(yǎng)基,37℃孵育16小時(shí)后,測(cè)量細(xì)菌生長(zhǎng)擴(kuò)散環(huán)直徑,評(píng)價(jià)Br-LED209對(duì)其鞭毛動(dòng)力的影響。②用鼠傷寒沙門氏菌感染HeLa細(xì)胞,感染后1、6、12小時(shí)裂解細(xì)胞,裂解液梯度稀釋后涂布瓊脂平板計(jì)數(shù)細(xì)菌 CFU,評(píng)價(jià)Br-LED209對(duì)鼠傷寒沙門氏菌上皮細(xì)胞

9、侵襲力及細(xì)胞內(nèi)增殖力的影響。③用鼠傷寒沙門氏菌感染腹腔巨噬細(xì)胞,1小時(shí)后,收集培養(yǎng)上清,檢測(cè)上清中乳酸脫氫酶(LDH)釋放量,并拍照記錄感染后巨噬細(xì)胞形態(tài),評(píng)價(jià)Br-LED209對(duì)鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡(pyroptosis)的影響;采用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和碘化丙啶(PI)對(duì)感染巨噬細(xì)胞進(jìn)行組合染色,熒光顯微鏡下觀察PI陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算PI陽性細(xì)胞百分率,評(píng)價(jià)Br-LED209對(duì)鼠傷寒沙門氏菌感染巨

10、噬細(xì)胞焦亡率的影響。④鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細(xì)胞,1小時(shí)后提取上清蛋白,western blotting蛋白印跡法檢測(cè)巨噬細(xì)胞caspase-1和IL-1β的表達(dá)水平,評(píng)價(jià)Br-LED209對(duì)感染后巨噬細(xì)胞炎性復(fù)合體功能的影響。⑤鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細(xì)胞12小時(shí)后,裂解細(xì)胞,裂解液梯度稀釋后涂布瓊脂平板計(jì)數(shù)細(xì)菌CFU,評(píng)價(jià)Br-LED209對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌存活率的影響。
　　結(jié)果:
　　1.合成結(jié)構(gòu)正確的QseC

11、選擇性抑制劑Br-LED209:合成的Br-LED209為淡黃色固體,熔點(diǎn)116～120℃,質(zhì)譜測(cè)得其分子量為460.16,與理論值460.99基本相符,核磁共振氫譜和碳譜結(jié)果顯示各歸屬與目標(biāo)產(chǎn)物一致,純度大于95%,表明合成產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)匹配無誤,可以用于下一步研究。
　　2.Br-LED209不影響體外培養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng):MIC測(cè)定結(jié)果顯示,Br-LED209在256μg/mL濃度時(shí)未顯示出明顯抑制鼠傷寒沙門氏菌、腸出血性大腸

12、桿菌和福氏志賀菌的作用;細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的結(jié)果顯示,Br-LED209在10~200μM濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無影響。上述結(jié)果確證,Br-LED209在體外無明顯抑菌作用。
　　3.Br-LED209顯著減少鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠臟器荷菌量:鼠傷寒沙門氏菌感染BALB/c小鼠,于感染前、感染后3小時(shí),分別灌胃給予Br-LED20920 mg/kg,感染后24小時(shí)取肝臟、脾臟、肺臟和腎臟標(biāo)本檢測(cè)臟器內(nèi)細(xì)菌數(shù)量。結(jié)果顯示,空白對(duì)照組小鼠肝臟

13、、脾臟、肺臟、腎臟內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量分別為6.03×107 CFU、1.04×108 CFU、1.02×106 CFU和8.02×105 CFU,感染小鼠經(jīng)Br-LED209處理后,其肝臟、脾臟、肺臟、腎臟內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量分別減少至1.01×107 CFU、2.06×107 CFU、1.68×105 CFU和1.33×105 CFU,與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.001)。同時(shí),Br-LED209處理后能減輕感染小鼠肝臟、脾臟的病理損傷。上述結(jié)

14、果提示,Br-LED209處理能夠降低細(xì)菌致病毒力,抑制細(xì)菌在感染小鼠體內(nèi)的存活和增殖能力。我們推測(cè) Br-LED209上述作用可能與其降低細(xì)菌毒力,啟動(dòng)機(jī)體天然免疫抗菌應(yīng)答效應(yīng)相關(guān)。
　　4.Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌毒力基因的表達(dá):阻斷細(xì)菌QseC可能會(huì)影響受其調(diào)控的下游基因表達(dá)。我們采用熒光定量PCR檢測(cè)受QseC調(diào)控的鼠傷寒沙門氏菌毒力基因的表達(dá),結(jié)果顯示Br-LED209在200μM濃度時(shí)能夠顯著抑制毒力基因f

15、lhDC、sifA和sopB的表達(dá)(P<0.001)。
　　5.Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛動(dòng)力、上皮細(xì)胞侵襲力和細(xì)胞內(nèi)增殖力:鼠傷寒沙門氏菌是致病力極強(qiáng)的腸道致病菌,它通過鞭毛運(yùn)動(dòng)侵襲上皮細(xì)胞,突破上皮防御屏障入侵機(jī)體發(fā)揮致病作用。我們?cè)谏鲜鲅芯恐凶C實(shí),Br-LED209能夠抑制鞭毛蛋白相關(guān)基因flhDC、侵襲相關(guān)基因sopB,以及增殖相關(guān)基因sifA的表達(dá)。因此,我們進(jìn)一步觀察Br-LED209對(duì)鼠傷寒沙門氏菌鞭

16、毛功能、上皮細(xì)胞侵襲能力和胞內(nèi)增殖能力的影響。結(jié)果顯示,Br-LED209能抑制鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛動(dòng)力,從而抑制該菌運(yùn)動(dòng)(P<0.05);顯著抑制鼠傷寒沙門氏菌對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲力,同時(shí)抑制細(xì)菌在HeLa細(xì)胞內(nèi)的增殖(P<0.001)。
　　6.Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡,促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的清除:為了進(jìn)一步探討B(tài)r-LED209降低感染器官中的細(xì)菌數(shù)量的機(jī)理,我們采用鼠傷寒沙門氏菌與巨噬細(xì)胞共

17、培養(yǎng)模型,進(jìn)一步觀察了巨噬細(xì)胞對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的免疫應(yīng)答效應(yīng)。結(jié)果顯示,鼠傷寒沙門氏菌感染的巨噬細(xì)胞,LDH的釋放量顯著增加,PI陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增加,表明受感染細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷,細(xì)胞發(fā)生焦亡。Br-LED209處理后,受感染巨噬細(xì)胞LDH的釋放顯著減少(P<0.001),PI染色陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(P<0.001),同時(shí)受感染細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目顯著減少(P<0.001),提示巨噬細(xì)胞焦亡受到抑制,巨噬細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)感染細(xì)菌的清除

18、力增強(qiáng)。
　　7.Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌感染引起的巨噬細(xì)胞內(nèi) caspase-1和IL-1β的活化:為了進(jìn)一步探討B(tài)r-LED209如何抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡,我們觀察了感染后巨噬細(xì)胞內(nèi)炎性復(fù)合體活化相關(guān)蛋白caspase-1和IL-1β的成熟過程。結(jié)果顯示,受感染的巨噬細(xì)胞 caspase-1和IL-1β釋放顯著增多,Br-LED209處理后,顯著降低感染巨噬細(xì)胞caspase-1和IL-1β的釋

19、放(P<0.001),提示Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌感染引起的巨噬細(xì)胞炎性復(fù)合體激活,并可能通過抑制巨噬細(xì)胞焦亡的發(fā)生,恢復(fù)巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的清除能力。
　　結(jié)論:
　　1.Br-LED209通過阻斷鼠傷寒沙門氏菌QseC群體感應(yīng)系統(tǒng),抑制flhDC、sifA和sopB等毒力基因表達(dá),進(jìn)而抑制細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力、上皮細(xì)胞侵襲能力和胞內(nèi)增殖能力。
　　2.Br-LED209抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡,恢復(fù)