細(xì)菌群體感應(yīng)抑制因子的篩選與活性研究.pdf

1、隨著人類抗生素濫用,耐藥病原菌數(shù)量日益增長,傳統(tǒng)抗生素治療感染性疾病已難達(dá)到預(yù)期效果。因此,尋求一種新型抗生素藥物或抗菌策略來對(duì)抗耐藥菌株引起的感染疾病至關(guān)重要。細(xì)菌群體感應(yīng)(Quorum sensing,QS)是細(xì)菌通過自發(fā)產(chǎn)生、釋放一些特定的信號(hào)分子,感知其濃度變化,激活大量基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)微生物生物熒光、毒力因子、生物被膜和孢子形成等生物功能的過程。細(xì)菌QS并不是影響細(xì)菌生長的重要過程,因此以細(xì)菌QS為靶標(biāo),通過阻礙信號(hào)分子與受

2、體在體內(nèi)的有效結(jié)合來誘導(dǎo)病原菌衰竭成為研發(fā)抗菌藥物的新策略。
　　本文主要目的是利用細(xì)菌QS篩選模型從海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物以及中藥粗提物中篩選新型群體感應(yīng)抑制劑(Quorum sensing inhibitors,QSI),并確定其結(jié)構(gòu),評(píng)價(jià)其生物活性。
　　從海南三亞沿岸采集海藻、海水和海泥,從中分離得到海洋真菌、放線菌和酵母菌共170余株,利用細(xì)菌 QS模型菌株銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginos

3、a)QSIS-lasI、PQSI-pqsA和紫色桿菌(Chromobacterium violaceum) CV026對(duì)發(fā)酵粗提物進(jìn)行活性篩選。其中真菌SY004、SY012和SY029具有較好的抗細(xì)菌QS活性,選擇其中對(duì)P. aeruginosa和C. violaceum均有活性的SY029進(jìn)一步研究。通過18S rDNA序列比對(duì)進(jìn)行菌種鑒定,該菌株應(yīng)屬Aspergillus,命名為 Aspergillus sp. SY029,同時(shí)采

4、用硅膠柱色譜( silica gel column chromatographic)、 LH-20凝膠柱色譜( Sephadex LH-20 gel column chromatography)和高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)等技術(shù)結(jié)合活性追蹤檢測分離純化活性化合物,核磁質(zhì)譜分析確定其結(jié)構(gòu)為丁內(nèi)酯-I(butyrolactone-I)?；钚詸z測結(jié)果表明該化合物在不抑

5、制細(xì)菌生長的濃度范圍內(nèi),能明顯地降低P. aeruginosa毒力因子作用,如彈性蛋白酶活性和綠膿菌素產(chǎn)量等。為了排除P. aeruginosa自身環(huán)境以及細(xì)胞內(nèi)其他QS系統(tǒng)作用干擾,利用大腸桿菌(Escherichia coli)異源QS報(bào)告菌株MG4/pKDT17和 pEAL08-2檢測丁內(nèi)酯-I對(duì)于las和PQS群體感應(yīng)系統(tǒng)影響,結(jié)果表明丁內(nèi)酯-I能夠特異性地抑制las與PQS群體感應(yīng)系統(tǒng)。丁內(nèi)酯-I對(duì)于C. violaceum群

6、體感應(yīng)調(diào)控相關(guān)的紫色菌素產(chǎn)量也具有明顯的抑制作用。
　　傳統(tǒng)中藥在現(xiàn)代醫(yī)藥中廣泛應(yīng)用于治療人類多種疾病。近年來,科學(xué)家在中藥材中發(fā)現(xiàn)多種QSI,可見中藥材也是篩選QSI的重要寶庫。通過篩選近70種中藥粗提物,發(fā)現(xiàn)牡丹皮和秦皮具有較好的抗細(xì)菌 QS活性。利用生物自顯影(bioautography)、薄層色譜(thin layer chromatography,TLC)和HPLC技術(shù)首次證明牡丹皮中 QSI為丹皮酚,秦皮中 QSI為秦

7、皮素。丹皮酚在亞抑菌濃度下能夠明顯降低C. violaceum紫色菌素產(chǎn)量和生物被膜形成,同時(shí)抑制了QS相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)。秦皮素對(duì)于P. aeruginosa PAOI毒力因子,包括彈性蛋白酶活力、綠膿菌素產(chǎn)量以及 swarming運(yùn)動(dòng)都具有一定的抑制作用,同時(shí)能夠明顯降低C. violaceum紫色菌素的生成。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)于新型 Q SI的篩選來源主要為海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物和傳統(tǒng)中藥材。海洋微生物具有物種以及遺傳多