AngⅡ及其1型受體拮抗劑對新生鼠心肌細胞凋亡影響及機制的實驗研究.pdf

1、目的：細胞凋亡即程序性死亡，1972年由kerr等在研究腫瘤細胞形態(tài)時首次發(fā)現(xiàn)并報道，是細胞在基因嚴格控制下的一種細胞死亡形式。對器官和組織的正常發(fā)育、維持平衡是必不可少的。但是，過度凋亡將造成平衡的破壞導致機體發(fā)病。近年來，隨著對凋亡研究的深入，人們認識到心肌細胞存在凋亡現(xiàn)象，是許多心臟疾病發(fā)病的細胞學基礎。因此心肌細胞凋亡受到廣泛的關注，成為生命科學中關注的熱點。近年來的試驗表明，心肌組織具有自身RAS，心肌細胞具有AngⅡ受體，分

2、為1型、2型。目前已知，缺血再灌注誘導心肌細胞凋亡與線粒體損傷有關。但對于AngⅡ參與心肌細胞凋亡作用及其機制卻了解不甚透徹。本研究旨在通過體外原代培養(yǎng)心肌細胞技術，探討AngⅡ對心肌細胞凋亡及早期轉錄調(diào)節(jié)因子c-fos、PCNA蛋白表達，iNOS、Bcl-2蛋白表達變化及caspases活性變化的作用。同時加入1型受體拮抗劑伊貝沙坦(irbesartan)與AngⅡ共同干預，觀測其1型受體拮抗劑對心肌細胞凋亡率及上述指標的影響。

3、 材料與方法：1.應用胰蛋白酶分步消化法進行體外Wistar大鼠新生鼠心肌細胞原代培養(yǎng)，采用特異性免疫組化染色方法鑒定所培養(yǎng)的心肌細胞。2.將培養(yǎng)96h的心肌細胞分為三組：對照組，采用無血清培養(yǎng)2h，6h，12h，24h；AngⅡ組，采用無血清含10-7mol/LAngⅡ培養(yǎng)基培養(yǎng)2h，6h，12h，24h，模擬心肌受損后局部自分泌、旁分泌作用；AugⅡ+AngⅡ1型受體拮抗劑irbesartan組，采用無血清含10-7mol/LAn

4、gⅡ，10-5mol/LIrbesartan培養(yǎng)基培養(yǎng)2h，6h，12h，24h。3.用免疫組化、TUNEL、熒光分光光度測定及RT-PCR等方法，分別觀察不同時間點對照組、AngⅡ、AngⅡ+AngⅡ1型受體拮抗劑irbesartan組，原代培養(yǎng)心肌細胞凋亡小體數(shù)量，Bcl-2、iNOS、PCNA，c-Fos蛋白染色變化，caspase-9mRNA表達改變，caspase-3蛋白酶活性改變。探討AngⅡ、AngⅡ和1型受體拮抗劑irb

5、esartan對心肌細胞上述指標的影響。 結果：1.原代培養(yǎng)的新生鼠心肌細胞呈梭形、三角形及不規(guī)則形。其中，梭形細胞占培養(yǎng)細胞的大多數(shù)，胞體呈細長的梭形，胞質折光性強，搏動明顯。細胞具有合抱生長趨勢。采用特異性小鼠抗大鼠α-心肌肌動蛋白免疫組化染色，可見細胞漿中大量棕紅色絲狀陽性著色，胞核不著色。 2.TUNEL法檢測心肌細胞凋亡小體數(shù)：在觀察的24h對照組不同時間點均可見到少量心肌細胞凋亡小體。AngⅡ組心肌細胞于刺激

6、2h與對照組相比無顯著型差異(p＞0.05)。但隨著時間的延長心肌細胞凋亡小體數(shù)量增多，以時間依賴方式進行。加入irbesartan與AngⅡ共同培養(yǎng)心肌細胞，凋亡小體數(shù)與相同時間點AngⅡ組相比下降，存在顯著性差異(p＜0.01)，但與對照組相比也存在差異(P＜0.01)。 3.免疫組化染色：①Bcl-2蛋白染色陽性細胞于刺激2h，三組間相比無明顯差異。但隨著時間延長與對照組比較，AngⅡ組明顯減少(P＜0.01)。AngⅡ+

7、irbesartan組心肌細胞Bcl-2蛋白染色陽性較AngⅡ組增多(P＜0.01)，但與對照組相比亦存在差異(P＜0.01)。②c-fos蛋白表達在AngⅡ組2h時表達明顯增強，6h開始下降，12h三組間幾乎看不到有差異存在(P＞0.05)，AngⅡ+irbesartan組，2hc-fos表達受到明顯抑制(P＜0.01)。③PCNA蛋白在對照組4個時間點均可見到少量表達。AngⅡ刺激2h時表達明顯增強，持續(xù)到6h(p＜0.01)，之后

8、表達逐步下降，12h三組間相比無明顯差異(P＞0.05)。AngⅡ+irbesartan組，2hPCNA蛋白表達明顯降低(p＜0.01)。④iNOS染色陽性細胞在AngⅡ刺激2h與對照組相比明顯增多(P＜0.01)，6h達高峰，之后隨時間延長逐步下降，12h三組間相比無顯著性差異(P＞0.05)。AngⅡ+irbesartan組心肌細胞iNOS蛋白染色陽性細胞受到抑制(P＜0.01)。 4.熒光分光光度法測定caspase-3活

9、性：在觀察的24h內(nèi)，AugⅡ組心肌細胞caspase-3活性與對照組相比，在刺激2h開始升高，6h達高峰，持續(xù)24h未下降(P＜0.01)。AngⅡ+irbesartan組，心肌細胞的caspase-3活性與AugⅡ組比較受到明顯抑制(p＜0.01)。 5.用RT-PCR方法檢測培養(yǎng)心肌細胞caspase-9mRNA表達：AugⅡ可上調(diào)心肌細胞caspase-9mRNA表達，與caspase-3活性相比兩者表達變化趨勢一致，在

10、AugⅡ刺激2h開始增高，在觀察的24h內(nèi)持續(xù)處于高表達狀態(tài)。AngⅡ+irbesartan組心肌細胞caspase-9mRNA表達受到抑制。 結論： 1.AngⅡ可時間依賴性地誘導Wistar新生鼠體外原代培養(yǎng)心肌細凋亡。 2.AugⅡ誘導Wistar新生鼠原代培養(yǎng)心肌細胞凋亡，其作用可能通過AT1介導，促凋亡作用被AT1拮抗劑irbesartan抑制。 3.AngⅡ誘導Wistar新生鼠原代培養(yǎng)心肌細

11、胞凋亡，Bcl-2蛋白參與其凋亡調(diào)節(jié)過程。AugⅡ下調(diào)其蛋白表達，加入1型受體拮抗劑irbesartan蛋白表達上調(diào)。Bcl-2表達下調(diào)與促進凋亡發(fā)生有關。 4.AngⅡ誘導Wistar新生鼠原代培養(yǎng)心肌細胞凋亡以細胞內(nèi)caspase激活依賴方式進行，caspase-9、caspase-3均激活。 5.AngⅡ誘導Wistar新生鼠原代培養(yǎng)心肌細胞凋亡早期促凋亡基因c-Fos，PCNA表達增強，促進心肌細胞凋亡。1型受體