醛固酮受體拮抗劑促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和心肌梗死后再生.pdf

1、目的：
　　眾所周知，人類心肌細(xì)胞增殖再生能力極度有限，急性心肌梗死導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞喪失，盡管研究報(bào)道成年心臟存在少量的具有再生能力的心肌細(xì)胞，但是數(shù)量稀少的心肌細(xì)胞增殖分裂不足以對(duì)梗死的心肌組織進(jìn)行有效的修復(fù)。而成年低等脊椎動(dòng)物蠑螈和斑馬魚卻能夠通過心肌細(xì)胞再生對(duì)心肌梗死或者心尖切除所造成的心肌損傷進(jìn)行完全的修復(fù)。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)這一心臟再生現(xiàn)象也出現(xiàn)在出生后一周內(nèi)的小鼠，出生一周后小鼠心臟喪失再生的能力，目前相關(guān)機(jī)制未完全明

2、確。醛固酮（aldosterone，ALD）是一種具有鹽皮質(zhì)激素活性的類固醇，是一種重要的調(diào)節(jié)體內(nèi)水液平衡的神經(jīng)內(nèi)分泌激素。近年來，醛固酮被證明可由心臟組織合成分泌，而其在心臟中的病理生理作用也得到學(xué)者們的關(guān)注。例如醛固酮可在心力衰竭時(shí)可作用于心肌細(xì)胞，通過鹽皮質(zhì)激素受體促使心肌細(xì)胞肥大。CYP11B2是醛固酮合酶mRNA，醛固酮的合成有賴于CYP11B2發(fā)揮其生理作用，有趣的是，斑馬魚并不具備CYP11B2基因。研究發(fā)現(xiàn)醛固酮在人類新

3、生兒出生時(shí)存在一個(gè)濃度高峰。剛出生的乳鼠血漿醛固酮水平要遠(yuǎn)高于健康成年小鼠（817.1 pg/ml VS99±43 pg/ml）。綜上所述，我們假設(shè)醛固酮可能與哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞出生后細(xì)胞周期停滯和形成雙核有關(guān)。
　　方法：
　　⑴將新出生24小時(shí)內(nèi)ICR乳鼠隨機(jī)分為依普利酮注射組和溶劑對(duì)照組，按照100mg/kg·day劑量連續(xù)注射14天，取心臟心室部分固定消化心肌細(xì)胞，DAPI染色并對(duì)心肌細(xì)胞單雙核計(jì)數(shù)分析，以此研究醛固酮

4、受體拮抗劑對(duì)心肌細(xì)胞單雙核比例的影響。⑵出生24小時(shí)內(nèi)ICR乳鼠，分離獲取并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分為4組：control組（僅給予藥物的溶劑對(duì)照組）；EPL組（僅依普利酮預(yù)處理，無醛固酮處理）；ALD組（無依普利酮預(yù)處理的醛固酮處理組）；EPL+ALD（依普利酮預(yù)處理及醛固酮處理），將處理后的心肌細(xì)胞固定并用熒光雙標(biāo)法標(biāo)志心肌細(xì)胞 ki67及 alpha-橫紋肌肌動(dòng)蛋白抗體，觀察 ki67陽性心肌細(xì)胞比例并組間對(duì)比，分析醛

5、固酮受體拮抗劑對(duì)原代心肌細(xì)胞增殖分裂情況的影響。⑶新出生24小時(shí)內(nèi)ICR乳鼠隨機(jī)分為醛固酮受體拮抗劑組（螺內(nèi)酯）和溶劑對(duì)照組，按照50mg/kg·day劑量連續(xù)注射21天，結(jié)扎心臟左前降支，建立急性心梗模型，術(shù)后第7天取心臟固定，OCT膠包埋制成5μm厚冰凍切片，通過橫紋肌肌動(dòng)蛋白和ki67熒光雙標(biāo)法，觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組心臟梗死交界區(qū) ki67陽性心肌細(xì)胞情況，分析醛固酮受體拮抗劑預(yù)處理對(duì)心肌梗死后小鼠心肌細(xì)胞增殖情況的影響；術(shù)后4周取

6、心臟4多聚甲醛固定，石蠟包埋，馬松三色染色法觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組心肌纖維化水平的對(duì)比情況。⑷取出生day0 day3 day5小鼠腎上腺組織，出生day0 day3 day5 day14小鼠心臟組織，勻漿提取組織總RNA，PCR法分析乳鼠腎上腺，心臟醛固酮合酶mRNA CYP11B2在出生后不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平變化情況。
　　結(jié)果：
　?、僖榔绽⑸浣M單核心肌細(xì)胞比例（21.91％）顯著高于溶劑對(duì)照組（9.82%），差異有統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義，P<0.001。②各組陽性ki67心肌細(xì)胞百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。其中：EPL+ALD組（8.83%）及EPL組（8.423%），ki67陽性率均高于control組（5.033%）及ALD組（5.5%）， P<0.01。提示抑制醛固酮受體增加單核心肌細(xì)胞比例。③螺內(nèi)酯注射組術(shù)后7天，螺內(nèi)酯注射組小鼠心臟梗死交界區(qū)心肌細(xì)胞 ki67陽性心肌細(xì)胞（9.792±0.602， n=4）顯著高于對(duì)照組（4.763±0.46

8、1， n=4），P<0.001。術(shù)后28天，我們將兩組小鼠制作成石蠟切片并行馬松染色觀察心臟組織纖維化情況。結(jié)果顯示，螺內(nèi)酯處理組心肌梗死小鼠心臟纖維化面積（14.93±1.08%，n=3）顯著小于單純急性心梗模型組（27.36%±1.22%，n=4），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.001，提示螺內(nèi)酯促進(jìn)心肌梗死后小鼠梗死交界區(qū)心肌細(xì)胞增殖，抑制心肌梗死后纖維化。④第0天全心醛固酮合酶mRNA（CYP11B2）表達(dá)水平明顯高于第3天、第5天

9、、第14天，P<0.001；第3天，第5天及第14天CYP11B2表達(dá)水平則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示 CYP11B2在 ICR乳鼠出生時(shí)心臟呈高表達(dá)，并在隨后幾天內(nèi)快速降至穩(wěn)定水平，而腎上腺組織CYP11B2表達(dá)水平穩(wěn)定，并無此變化。
　　結(jié)論：
　?、湃┕掏荏w拮抗劑可能具有抑制心肌細(xì)胞周期停滯和雙核形成的能力。⑵醛固酮受體拮抗劑無論在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)都表現(xiàn)出促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的能力。⑶醛固酮/醛固酮受體介導(dǎo)的效應(yīng)可能與成年哺乳