AngⅡ受體拮抗劑坎地沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察坎地沙坦（Cand）對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞株A7r5增殖和分泌血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的影響，并探討其機(jī)制。
　　方法：根據(jù)葡萄糖濃度將A7r5細(xì)胞分為兩組，正常糖濃度組（NG，5mM）、高糖組（HG，15、25、35、45mM）將各組細(xì)胞培養(yǎng)48h后，采用CCK-8法測(cè)定培養(yǎng)基吸光度值（OD值）以確定最佳葡萄糖濃度。再按照該濃度分別培養(yǎng)A7r5細(xì)胞0、24、48、72h后用CCK-8法測(cè)定培養(yǎng)基OD值以確定最佳培

2、養(yǎng)時(shí)間。用選定的葡萄糖濃度及培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。Cand選定了3個(gè)濃度，分別為HG（25mM）+Cand10-7mol/L、HG（25mM）+Cand10-6mol/L、HG（25mM）+Cand10-5mol/L，采用CCK8法測(cè)定OD值，從中擇選出最佳濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。最終分為NG（5mM）、HG（25mM）、HG（25mM）+Cand10-5mol/L三組，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A7r5增殖情況，以評(píng)價(jià)Cand對(duì)于高

3、糖誘導(dǎo)的A7r5增殖的影響。采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌AngⅡ水平、細(xì)胞免疫熒光染色法測(cè)定細(xì)胞膜表面AT1R。最后采用Western blot法檢測(cè)p-c-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平以探討Cand對(duì)A7r5增殖和分泌AngⅡ影響的機(jī)制。
　　結(jié)果：1、（1）CCK-8法測(cè)定最佳葡萄糖濃度：細(xì)胞培養(yǎng)48h后，與NG（5mM）組相比，HG（15、25、35、45mM）濃度下誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞，OD值均明顯

4、升高，且以HG(25mM)組OD值為（1.044±0.074）增高最為明顯，與NG（5mM）OD值（0.681±0.055）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；（2）CCK-8法測(cè)定最佳培養(yǎng)時(shí)間：HG（25mM）組細(xì)胞培養(yǎng)0h（0.436±0.006）相比較，細(xì)胞培養(yǎng)24h（0.717±0.018）、48h（1.044±0.074）、72h（1.062±0.067）OD值均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）。而48h和72

5、h相比，其OD值差異無(wú)顯著性（P>0.05）；（3）CCK-8法測(cè)定最佳Cand濃度：A7r5細(xì)胞經(jīng)48h培養(yǎng)后，HG（25mM）+Cand10-5mol/L組OD值為（0.920±0.010），與HG(25mM)組OD值（1.126±0.080）相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.01）,而HG(25mM)+Cand10-7mol/L、HG(25mM)+Cand10-6mol/L組較HG（25mM）組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。（4）細(xì)胞

6、計(jì)數(shù)法結(jié)果：A7r5細(xì)胞培養(yǎng)48h后，與HG(25mM)組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果（77.33±2.52）相比，HG（25mM）+Cand10-5mol/L組細(xì)胞數(shù)（64.67±1.16）明顯減少，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。（5）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與NG(5mM)組比較，HG(25mM)組A7r5細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞周期S期比例[(30.503±1.521)％]明顯增加(P<0.01)。與HG(25mM)組比較，HG（25mM）

7、+Cand10-5mol/L組A7r5細(xì)胞增殖活性下降，細(xì)胞周期S期比例［(21.677±1.690)%］下降，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。2、（1）ELISA法測(cè)AngⅡ結(jié)果顯示：NG（5mM）組OD值為（55.268±0.310）與HG（25mM）組OD值（59.934±0.121）相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.01）。而HG（25mM）+Cand10-5mol/L組與HG（25mM）組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。（2

8、）細(xì)胞免疫熒光染色法測(cè)定結(jié)果：與NG（5mM）組比較，HG（25mM）組細(xì)胞膜上AT1R表達(dá)增加，與HG（25mM）比較，HG（25mM）+Cand10-5mol/L組AT1R表達(dá)減少。3、Western blot結(jié)果顯示：與NG（5mM）組p-c-Raf（0.836±0.039）、p-MEK1/2（1.032±0.034）、p-ERK1/2(1.472±0.089)比較，HG（25mM）組p-c-Raf（1.060±0.087）、p-

9、MEK1/2（1.155±0.064）、p-ERK1/2(1.924±0.065)蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上調(diào)（p<0.01）。與HG（25mM）組相比,HG（25mM）+Cand10-5mol/L組p-c-Raf(0.658±0.039)、p-MEK1/2(0.821±0.049)、p-ERK1/2(0.795±0.028)蛋白表達(dá)下調(diào)（p<0.01）。
　　結(jié)論：1.高糖促進(jìn)A7r5增殖、升高AngⅡ分泌水平。2.坎地沙坦抑制高糖誘