miR-27a介導(dǎo)GLP-1受體激動(dòng)劑抑制心肌細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病(DM)是由遺傳及環(huán)境在內(nèi)的多種因素共同引起的一組以慢性血糖水平升高為特征的代謝性疾病。心血管疾病是 DM的主要并發(fā)癥之一。近年來(lái)研究證實(shí)，糖尿病心肌病(DCM)與 DM患者心血管疾病的高發(fā)病率和高死亡率密切相關(guān)。而心肌細(xì)胞凋亡是DCM的主要發(fā)病機(jī)制之一。利拉魯肽(LR)是人工合成的胰高血糖素樣肽-1(GLP-l)受體激動(dòng)劑，不僅能發(fā)揮降糖作用，還具有心血管系統(tǒng)保護(hù)作用。微小 RNA(miRNA)是一類保守的內(nèi)源

2、性非編碼單鏈小分子RNA，其在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。miR-27a是目前研究較多的與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的miRNA。而我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1可通過(guò)激活A(yù)MPK抑制心肌細(xì)胞miR-27a的表達(dá)。因此本研究旨在探討GLP-1受體激動(dòng)劑LR是否通過(guò)抑制心肌細(xì)胞miR-27a的表達(dá)，發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，從而為其在防治DCM、降低DM患者心血管疾病死亡率中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.低糖培養(yǎng)

3、H9c2心肌細(xì)胞，使用終濃度為150pmol和300pmol的miR-27a mimics以及終濃度為150pmol和300pmol的miR-27a inhibitor分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)，并設(shè)置正常對(duì)照組，用熒光定量PCR方法檢測(cè)各組miR-27a的表達(dá)水平，從而檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　2.低糖培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞，將其分為6組：正常對(duì)照組，脂質(zhì)體 lipo2000組(lipo2000組)，150pmol低濃度轉(zhuǎn)染miR-27a

4、mimics組(miR-27a150pmol組)，300pmol高濃度轉(zhuǎn)染miR-27a mimics組(miR-27a300pmol組)及轉(zhuǎn)染其各自陰性對(duì)照組(miR-27a N.C150pmol組、miR-27a N.C300pmol組)。轉(zhuǎn)染后作用48小時(shí)，用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　3.培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，分為低糖組(LG組)，高糖組(HG組)，高糖+miR-27a mimics組(mimics組)，高糖+mi

5、R-27a inhibitor組(inhibitor組)，高糖+miR-27a mimics N.C組(mimics N.C組)，高糖+miR-27a inhibitor N.C組(inhibitor N.C組)，高糖+脂質(zhì)體lipo2000組(lipo組)，高滲組(HO組)，各組轉(zhuǎn)染終濃度均為300pmol，轉(zhuǎn)染后作用48小時(shí)，用熒光定量PCR方法檢測(cè)miR-27a的表達(dá)水平，Western Blotting方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白B

6、ax、Bcl-2、caspase-3、cIAP-1、Apaf-1蛋白的表達(dá)水平，并用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　4.高糖培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，分為對(duì)照組，利拉魯肽組(LR組)，miR-27a mimics組，LR+miR-27a mimics組，LR+miR-27a mimics N.C組，LR+lipo2000組，利拉魯肽的干預(yù)濃度為1000nmol/L，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染終濃度均為300pmol。作用48小時(shí)后，用熒光定量PC

7、R方法檢測(cè)miR-27a的表達(dá)水平，并用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1.相較于對(duì)照組，低濃度和高濃度轉(zhuǎn)染miR-27a mimics組，其miR-27a的表達(dá)水平均升高(P<0.05)，且高濃度轉(zhuǎn)染組miR-27a的表達(dá)水平較低濃度轉(zhuǎn)染組明顯升高(P<0.05)。與對(duì)照組相比，當(dāng)轉(zhuǎn)染150pmol的miR-27a inhibitor時(shí)，miR-27a表達(dá)已被明顯抑制(P<0.05)，在轉(zhuǎn)染300pmol

8、miR-27a inhibitor時(shí)，miR-27a表達(dá)近乎完全被抑制(P<0.05)。
　　2.與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-27a mimics組，其心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)呈濃度依賴性升高(P<0.05)，而lipo2000組、miR-27a N.C150pmol組、miR-27a N.C300pmol組的細(xì)胞凋亡指數(shù)較對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　3.在高糖狀態(tài)下，轉(zhuǎn)染miR-27a mimics組，其miR-27a表

9、達(dá)水平及細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染inhibitor組，其miR-27a表達(dá)明顯受到抑制且細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05)，而lipo2000組、mimics N.C組和inhibitor N.C組與高糖對(duì)照組相比均未引起 miR-27a表達(dá)水平的變化以及細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化(P>0.05)。而高滲組miR-27a含量與低糖對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4.Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，m

10、iR-27a mimics組Bax、caspase-3及Apaf-1蛋白表達(dá)水平升高，而inhibitor組Bax、caspase-3及Apaf-1蛋白表達(dá)水平降低，且兩組之間的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同時(shí)，miR-27a mimics組Bcl-2、cIAP-1蛋白表達(dá)水平降低，而inhibitor組Bcl-2、cIAP-1蛋白表達(dá)水平升高，且兩組之間的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　5.與對(duì)照組比較，單純給予利

11、拉魯肽干預(yù)組，其miR-27a表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)。而miR-27a mimics組及LR+miR-27a mimics組，其miR-27a表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，且LR+miR-27a mimics組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較miR-27a mimics組降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.miR-27a可促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，且呈濃度依賴性。
　　2.