干擾DRAM1基因?qū)Ω伟〩epG2細(xì)胞遷移侵襲能力的影響及與自噬之間關(guān)系研究.pdf

1、目的:探討干擾DRAMl基因在體外對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞迀移侵襲能力的影響,并對(duì)自噬與干擾DRAMl基因造成的細(xì)胞迀移侵襲能力的影響之間關(guān)系進(jìn)行初步研究。
　　方法:選用人肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。脂質(zhì)體Lipofectamine2000與化學(xué)合成雙鏈DRAMlsiRNAl/2混合,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染干擾肝癌HepG2細(xì)胞DRAMl基因表達(dá)后48小時(shí),Western blot檢測(cè)干擾DRAMl基因表達(dá)后DRAMl蛋白表達(dá)情況并檢測(cè)其干擾效率

2、;隨后,Western blot檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)相關(guān)標(biāo)記蛋白表達(dá)情況;應(yīng)用tmnswell小室檢測(cè)細(xì)胞迀移侵襲能力變化。為了進(jìn)一步研究干擾DRAMl基因造成的細(xì)胞迀移侵襲能力的影響與自噬之間關(guān)系,干擾DRAMl基因表達(dá)后,用Western blot及細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白水平變化;同上方法,利用化學(xué)合成的雙鏈ATG5 s i R N A,轉(zhuǎn)染干擾

3、肝癌HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)基因ATG5表達(dá)后48小時(shí),Western blot檢測(cè)ATG5蛋白表達(dá)情況并檢測(cè)其干擾效率;Western blot及細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白水平變化;transwell小室檢測(cè)干擾ATG5基因表達(dá)抑制自噬后肝癌HepG2細(xì)胞迀移侵襲能力變化。
　　結(jié)果:干擾DRAMl基因表達(dá)后48小時(shí),Western blot檢測(cè)顯示DRAMl siRNAl組和DRAMl siRNA2組DRAMl蛋白的表

4、達(dá)水平均明顯下調(diào),干擾效率較高;隨后應(yīng)用Western blot檢測(cè)干擾DRAMl基因表達(dá)后EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白表達(dá)變化顯示:E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào),Vimentin及Snail蛋白表達(dá)下調(diào);應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞的迀移侵襲能力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,迀移和侵襲實(shí)驗(yàn)透膜細(xì)胞數(shù)均明顯減少。干擾DRAMl基因表達(dá)后,利用Western Blot及細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化顯示,LC3(LC3-II)蛋白表達(dá)下調(diào),

5、P62蛋白表達(dá)上調(diào)。干擾ATG5基因表達(dá)后ATG5蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào),進(jìn)一步Western Blot及細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)記蛋白表達(dá)變化發(fā)現(xiàn),LC3(LC3-II)蛋白表達(dá)下調(diào),P62蛋白表達(dá)上調(diào),證明干擾ATG5后自噬被抑制,Tmnswell小室檢測(cè)結(jié)果顯示,干擾ATG5基因抑制自噬后,迀移和侵襲實(shí)驗(yàn)透膜細(xì)胞數(shù)亦均明顯減少。以上各實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:干擾DRAMl基因表達(dá)能使肝癌HepG2