微生態(tài)制劑對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟NKT細胞功能的影響.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是以肝細胞脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥伴灶性壞死為特征的一類遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性臨床病理綜合征。其發(fā)病機制尚未完全闡明。肝臟固有免疫及環(huán)境遺傳等多種因素可能共同參與NASH的發(fā)生進展。目前微生態(tài)制劑作為臨床輔助治療肝臟病的藥物應(yīng)用較為廣泛,但其對NASH的治療作用尚不明確。
　　 本實驗通過高脂飼料喂養(yǎng)大鼠建立NASH大鼠模型,并應(yīng)用微生

2、態(tài)制劑-雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌給予大鼠灌胃,觀察該藥物對NASH大鼠肝損傷中肝組織CD1d、NKT細胞及CXCL16等指標及腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-12等Th1型細胞因子水平的影響,旨在探討該藥物在NASH中可能的治療作用及其作用機制。
　　 方法:36只雄性健康Wistar大鼠隨機分為正常對照A組(造模0周)、正常對照B組、高脂飲食8周、

3、12周、16周組及雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌治療組。分別于造模0周、8周、12周、16周處死大鼠取材。并行HE、SudanⅣ、Masson染色,觀察肝組織炎癥、脂肪變性及纖維化程度；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)觀察肝組織CXCL16 mKNA、CD1d mRNA表達；免疫組織化學(xué)觀察CXCL16蛋白的表達；流式細胞儀檢測肝組織NKT細胞百

4、分含量；全自動生化儀檢測血清生化學(xué)指標；酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定血清TNF-α、IL-12水平。
　　 結(jié)果:
　　 1一般表現(xiàn):正常對照組大鼠皮毛有光澤、食欲佳,精神狀態(tài)好,體重逐漸增加；高脂組大鼠精神萎靡,活動減少,食欲減退,皮毛欠光澤,體重增加明顯；治療組大鼠精神、食欲及活動介于正常對照組與高脂組之間。
　　 2血清學(xué)指標的變化

5、r>　　 2.1血清學(xué)指標的動態(tài)變化
　　 高脂8周、12周、16周組大鼠血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平均較正常對照A組顯著升高(P均<0.01),且隨著造模時間延長而顯著升高；血清TNF-α水平:高脂8周、12周、16周組分別為11.39±2.59、21.2±5.18、28.23±4.31,均較正常對照A組(5.92±1.68)顯著升高(P均<0.01)；I

6、L-12水平:高脂8周、12周、16周組分別為49.493±8.024、68.392±7.302、78.957±12.434,均較正常對照A組(34.256±7.518)顯著升高(P均<0.01),以上結(jié)果表明隨著造模時間延長,大鼠血清TNF—α、IL-12水平逐漸升高。
　　 2.2微生態(tài)制劑對血清學(xué)指標的影響
　　 高脂16周組TC、TG、ALT、AST等指標分別為3.89±0.22、0.93±0.26、103.37

7、±20.11、154.82±17.59,較正常對照B組上述各指標(1.87±0.19、0.55±0.25、35.38±12.47、73.54±10.63)均顯著升高(P均

8、.01)；IL-12水平:治療組血清IL-12水平是37.562±7.557,顯著低于高脂16周組(78.957±12.434)(P<0.01)。
　　 3肝組織病理變化:肉眼觀察,正常對照組大鼠肝臟外觀為紅褐色,有光澤,質(zhì)軟；高脂組大鼠肝臟體積明顯增大,顏色為淺黃色,切面油膩感；治療組大鼠肝臟外觀介于正常對照組和高脂組之間。光鏡下,HE染色示正常對照組大鼠肝細胞索以肝小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝索結(jié)構(gòu)整齊；SudanⅣ染

9、色示肝細胞無脂肪滴,胞漿呈藍色；Masson三重染色示中央靜脈及匯管區(qū)未見明顯膠原纖維沉積。HE、SudanⅣ染色示高脂8周組大鼠部分肝細胞氣球樣變,胞漿內(nèi)充滿大量粉紅色脂滴,脂變的肝細胞以中央靜脈周圍最為明顯,中央靜脈周圍可見點狀壞死；高脂12周組可見肝細胞腫脹程度加重,胞漿內(nèi)粉紅色脂滴增多,中央靜脈周圍有炎癥細胞浸潤,炎性細胞以單個核細胞為主,可見灶性壞死；高脂16周組大鼠肝細胞彌漫性脂肪變,可見肝細胞內(nèi)充滿粉紅色脂滴,小葉內(nèi)彌漫性

10、肝細胞點、灶性壞死；治療組大鼠肝細胞內(nèi)粉紅色脂滴明顯減少,炎癥細胞浸潤明顯減少。Masson三重染色示高脂8周組、12周組大鼠肝組織中央靜脈、匯管區(qū)均未見明顯膠原纖維；高脂16周組大鼠肝組織可見肝竇周圍膠原纖維沉積；治療組大鼠中央靜脈、匯管區(qū)無明顯膠原纖維沉積。
　　 4流式細胞儀測定肝臟NKT細胞的百分含量
　　 4.1肝臟NKT細胞的百分含量的動態(tài)變化
　　 高脂8周、12周、16周組肝臟NKT細胞百分比分別

11、為(17.48±2.43)％、(15.08±1.81)％、(8.31±3.81)％,較正常對照A組肝臟NKT細胞百分比(25.26±2.56)％顯著降低(P均<0.01),肝臟NKT百分比隨著造模時間延長顯著下降(P均<0.01)。
　　 4.2微生態(tài)制劑對肝臟NKT細胞百分比的影響
　　 高脂16周組肝臟NKT細胞百分比(8.31±3.81)％較正常對照B組(22.94±2.65)％顯著降低；經(jīng)微生態(tài)治療后,肝臟NKT

12、細胞百分比為(16.90±1.96)％,較治療前顯著升高(P<0.01)。
　　 5 RT-PCR檢測CD1d mRNA、CXCL16 mRNA在大鼠肝組織的表達
　　 5.1大鼠肝組織CD1dmRNA、CXCL16 mRNA的動態(tài)變化
　　 大鼠肝組織CD1d mRNA表達:正常對照A組、高脂8周、12周、16周組大鼠肝組織CD1d mRNA相對含量分別為0.640±0.040、0.579±0.027、0.50

13、7±0.023、0.447±0.037,表明隨著造模時間延長,大鼠肝組織CD1d mRNA表達顯著下降(P均<0.01)；CXCL16 mRNA表達結(jié)果顯示,正常對照A組、高脂8周、12周、16周組大鼠肝組織CXCL16 mRNA相對含量分別為0.215±0.031、0.364±0.032、0.529±0.046、0.586±0.016,表明隨著造模時間延長,CXCL16 mRNA顯著升高(P均<0.01)。
　　 5.2微生態(tài)

14、制劑對大鼠肝組織CD1d mRNA、CXCL16 mRNA表達影響
　　 高脂16周組大鼠肝組織CD1d mRNA的相對含量為0.447±0.037,較正常對照B組(0.666±0.027)顯著降低；治療組大鼠肝組織CD1d mRNA相對含量為(0.559±0.044),較治療前顯著升高(P<0.01)；高脂16周組大鼠肝組織CXCL16 mRNA相對含量為0.586±0.016,較正常對照B組(0.217±0.034)顯著升高

15、；治療組大鼠肝組織CXCL16 mRNA相對含量為0.375±0.035,較治療前顯著降低(P<0.01)。
　　 6免疫組織化學(xué)法檢測CXCL16蛋白在大鼠肝組織的表達
　　 6.1大鼠肝組織CXCL16的動態(tài)變化
　　 正常對照組大鼠肝細胞漿內(nèi)有CXCL16微弱表達,相對表達為0.5±0.837；高脂組大鼠肝組織表達CXCL16明顯增強。高脂8周、12周、16周組大鼠肝組織CXCL16相對含量分別為10.67

16、±1.862、21.0±2.898、25.67±4.844,均較正常對照A組表達顯著升高(P均<0.01)；大鼠肝組織CXCL16表達從0周到12周逐漸升高(P均<0.01),但在高脂飲食12周后無顯著升高。
　　 6.2微生態(tài)制劑對大鼠肝組織CXCL16表達的影響
　　 高脂16周組大鼠肝組織CXCL16相對含量為25.6±4.844,較正常對照B組(0.67±1.211)顯著升高(P<0.01)；治療組大鼠肝組織陽性

17、表達細胞數(shù)減少,其CXCL16相對表達為8.67±2.805,較治療前顯著下降(P<0.01)。
　　 7相關(guān)分析表明,肝組織CD1d表達與肝組織NKT細胞百分含量存在直線相關(guān),r值為0.774,P<0.01；肝組織NKT細胞百分含量與血清TNF-α水平、IL-12水平、肝組織CXCL16蛋白含量呈負相關(guān),r值分別為-0.718、-0.767、-0.795,P值均<0.01。
　　 結(jié)論:
　　 1應(yīng)用高脂飲食的