角膜新生血管周?chē)g質(zhì)微環(huán)境與其生長(zhǎng)關(guān)系的研究.pdf

1、目的 研究角膜新生血管周?chē)g質(zhì)微環(huán)境與新生血管生長(zhǎng)之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討角膜新生血管的發(fā)生機(jī)制。 方法 (一)研究角膜新生血管形成時(shí)周?chē)g質(zhì)微環(huán)境的改變 1、建立不同形式的堿燒傷角膜新生血管動(dòng)物模型(1)單純堿燒傷角膜新生血管模型：選用Wister大鼠8只，將直徑3mm單層圓形濾紙片浸于1mol/LNaoH溶液中15s，濾紙吸出多余的溶液，貼于右眼角膜中央2min，取下濾紙，無(wú)菌生理鹽水沖洗1min。(2

2、)板層角膜移植層間新生血管模型：Wister大鼠24只為受體，SD大鼠為供體，建立同種異系板層角膜移植層間新生血管動(dòng)物模型。隨機(jī)分為4組，每組6只，均為右眼手術(shù)。3.0mm環(huán)鉆于Wister鼠角膜中央鉆切，深度達(dá)1/3-1/2角膜時(shí)，使用尖刀片剝除板層角膜，制作板層角膜植床。3.5mm環(huán)鉆取SD鼠角膜，制作角膜植片，10-0尼龍線間斷縫合8針于已剝除板層角膜的植床。A組：?jiǎn)渭儎兂悄?nèi)皮制作角膜植片。B組：手術(shù)方法同A，植片縫合前，將直

3、徑3mm浸有1mol/LNaoH濾紙片置于角膜植床中央20s，取下濾紙，生理鹽水沖洗30s。C組：角膜植片為從SD大鼠角膜剝下的板層角膜植片。D組：板層角膜植片聯(lián)合NaoH濾紙片燒灼。術(shù)后定期觀察照相及行組織病理學(xué)檢查。 2、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)角膜新生血管周?chē)g質(zhì)的改變堿燒傷Wister大鼠6只，術(shù)后3、5、7天分別處死2只，取角膜。板層角膜移植Wister大鼠2只，術(shù)后15天處死，取角膜。正常Wister大鼠2只，處死取角膜

4、，作為正常對(duì)照組。冰凍切片，免疫熒光法檢測(cè)兩種新生血管模型中TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1)、a-SMA(a-平滑肌肌動(dòng)蛋白)、FAP(成纖維細(xì)胞激活蛋白)的表達(dá)情況并觀察它們與新生血管之間的關(guān)系。以CD31(血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子)標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。 3、分子生物學(xué)方法驗(yàn)證FAP的表達(dá)采用RT-PCR方法檢測(cè)FAP在角膜中不同時(shí)間及位置的表達(dá)。制作4只Wister大鼠右眼堿燒傷血管模型，術(shù)后第3、7天分別處死2只。首先使用3

5、.0mm環(huán)鉆取中央堿燒傷角膜(A區(qū))，然后角鞏膜剪剪下周邊角膜(B區(qū))。對(duì)比正常角膜及不同時(shí)間AB區(qū)FAP的表達(dá)情況。 4、苦味酸天狼猩紅—偏振光法檢測(cè)角膜間質(zhì)中主要膠原的改變?nèi)≌４笫蠼悄ぁA燒傷后7天角膜、板層角膜移植術(shù)后15天角膜，石蠟切片，行苦味酸天狼猩紅染色后，應(yīng)用偏振光顯微鏡觀察新生血管角膜中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的變化。 5、超微結(jié)構(gòu)檢查取堿燒傷5天及板層角膜移植術(shù)后15天的角膜，行透射電鏡檢查，觀察角膜新生血管形

6、成時(shí)間質(zhì)的改變。 (二)間質(zhì)靶分子(FAP)誘導(dǎo)新生血管的研究 大鼠角膜基質(zhì)注射FAP，觀察是否可以誘導(dǎo)角膜新生血管。將18只Wister大鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，每組6只，均行右眼角膜基質(zhì)注射。A空白對(duì)照組注射生理鹽水，5ul；B組注射10ng/ulFAP，5ul；C組注射100ng/ul的FAP，5ul。術(shù)后，定期觀察，記錄新生血管積分，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 (一)角膜新生血管形成時(shí)周?chē)g質(zhì)微環(huán)境

7、的改變 1、動(dòng)物模型的建立：(1)堿燒傷組：燒傷后1天內(nèi)可見(jiàn)角膜緣血管網(wǎng)擴(kuò)張充血，第3天時(shí)NV已經(jīng)侵入角膜，第7～14天達(dá)到生長(zhǎng)旺盛期，長(zhǎng)入角膜中央，之后血管開(kāi)始逐漸退縮。病理檢查見(jiàn)血管生長(zhǎng)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。(2)板層角膜移植組：?jiǎn)渭儎兂悄ぶ财瑑?nèi)皮的全厚板層角膜移植聯(lián)合植床堿燒傷的方法成功制作出了層間新生血管模型，術(shù)后1天內(nèi)可見(jiàn)角膜緣血管網(wǎng)擴(kuò)張充血，第3天時(shí)NV已經(jīng)侵入角膜，第7天血管生長(zhǎng)到達(dá)植片與植床的連接處，15天左右層間新

8、生血管最為旺盛。病理檢查見(jiàn)層間血管生長(zhǎng)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。 2、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)角膜新生血管周?chē)g質(zhì)的改變堿燒傷后7天及板層角膜移植術(shù)后15天的角膜冰凍切片免疫熒光雙染顯示：兩種新生血管動(dòng)物模型角膜內(nèi)均含有a-SMA、FAP同時(shí)陽(yáng)性的細(xì)胞，對(duì)照正常角膜無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。FAP+基質(zhì)細(xì)胞位于CD31+的血管內(nèi)皮細(xì)胞周?chē)c血管內(nèi)皮細(xì)胞伴行生長(zhǎng)，兩者無(wú)明顯的先后順序。同時(shí)免疫熒光顯示角膜間質(zhì)TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)。 3、分子生物學(xué)方

9、法驗(yàn)證FAP的表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，正常角膜內(nèi)不含有FAP，堿燒傷3天A區(qū)角膜，不含有FAP；堿燒傷3天B區(qū)角膜，出現(xiàn)FAP。堿燒傷7天A區(qū)角膜，表達(dá)FAP；堿燒傷7天B區(qū)角膜，表達(dá)FAP。新生血管生長(zhǎng)到達(dá)的位置，出現(xiàn)FAP陽(yáng)性表達(dá)。 4、苦味酸天狼猩紅—偏振光法檢測(cè)角膜間質(zhì)中主要膠原的改變正常大鼠角膜以Ⅰ型膠原含量最多，折射率強(qiáng)，偏光鏡下呈亮黃、橙或紅色粗纖維狀；Ⅲ型膠原，折射率弱，偏光下為細(xì)長(zhǎng)的綠色纖維。角膜新生血管生長(zhǎng)

10、后Ⅰ型、Ⅲ型膠原重新排列以適應(yīng)新生血管的生長(zhǎng)。 5、超微結(jié)構(gòu)觀察透射電子顯微鏡下，堿燒傷角膜內(nèi)新生血管生長(zhǎng)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；板層角膜移植層間新生血管生長(zhǎng)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞周?chē)涣硗庖环N細(xì)胞包繞。 (二)間質(zhì)靶分子誘導(dǎo)新生血管的研究 A組術(shù)后3天角膜緣血管擴(kuò)張充血，7天時(shí)無(wú)新生血管長(zhǎng)入角膜；B組術(shù)后3天角膜緣血管擴(kuò)張充血，7天時(shí)新生血管開(kāi)始向注藥區(qū)域生長(zhǎng)，14天時(shí)長(zhǎng)入注藥區(qū)域；C組術(shù)后3天注藥區(qū)域角膜緣有新