血管抑素溶液在大鼠角膜新生血管中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　 病理性新生血管是多種眼部疾病中的一種表現(xiàn)，如:角膜新生血管、新生血管性青光眼、老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜新生血管、糖尿病視網(wǎng)膜病變。在歐美等國家，因眼部新生血管已成為導(dǎo)致失明的首要因素。我國作為發(fā)展中國家，眼部損傷是成為一種常見病、多發(fā)病，均可引起的角膜新生血管，約占角膜疾病的10％，其中角膜堿燒傷在角膜化學(xué)性損傷中后果尤為嚴重，因堿性溶液可不斷侵蝕角膜各層組織，所以它所致的失明是當前最突出、最棘手的問題。與角膜新

2、生血管密切相關(guān)疾病有:感染、眼外傷、角膜化學(xué)傷、免疫源性眼病等;其中又以化學(xué)傷中的堿燒傷后引起的角膜新生血管影響視力最明顯。
　　 正常角膜光滑透明無血管，盡管角膜新生血管的生長有利于清除局部感染、促進傷口愈合、抑制角膜溶解、促進組織修復(fù)等，但是由于其結(jié)構(gòu)和功能的不完善，易產(chǎn)生血漿滲漏、角膜水腫、炎性細胞浸潤，這些均會導(dǎo)致角膜喪失“免疫豁免”權(quán)限，引起視力下降、甚至視力喪失，影響角膜透明度及后續(xù)治療中的角膜移植。
　　

3、隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對角膜新生血管的研究深入，大量實驗研究發(fā)現(xiàn)角膜新生血管的形成是多因素參與的結(jié)果。
　　 1、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor VEGF）
　　 血管內(nèi)皮生長因子是1989年由Ferrara發(fā)現(xiàn)，是內(nèi)皮細胞特異性促有絲分裂原，通過特異性受體介導(dǎo)作用于血管內(nèi)皮細胞，對血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮促分化和趨化作用，并促進內(nèi)皮細胞增殖和遷移。同時增加血管通透性，以利于

4、新生血管和基質(zhì)細胞生長。血管內(nèi)皮生長因子在促進血管新生、維持血管形態(tài)及完整性具有重要意義。
　　 2、成纖維細胞生長因子(FGF)
　　 成纖維細胞生長因子是Gospodarowicz于1974年發(fā)現(xiàn)的一種促纖維母細胞生長因子，并廣泛存在于多種組織中。其生物學(xué)活性通過受體介導(dǎo)實現(xiàn);其中堿性FGF生物性最強，主要促進新生血管形成、促進血管平滑肌細胞、促進內(nèi)皮細胞增殖、參與組織修復(fù)和炎癥反應(yīng)等。
　　 3、白細胞介素

5、(IL)
　　 白細胞介素主要是由單核細胞產(chǎn)生的一組細胞因子，作用于巨噬細胞、淋巴細胞，也必須通過特異性受體介導(dǎo)才可發(fā)揮其生物活性，對細胞的激活、分化和增殖的作用。正常情況下 IL與其他細胞因子共同維持角膜的微環(huán)境;但是有實驗發(fā)現(xiàn)在損傷后角膜的中IL-8表達量明顯增高，可初步證明其對組織新生血管的影響為促進作用。
　　 4、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)
　　 轉(zhuǎn)化生長因子-β是由DeLarco在1978年發(fā)現(xiàn)，

6、其生物活性是通過受體信號傳導(dǎo)途徑實現(xiàn)，其對細胞增殖、分化和凋亡發(fā)揮調(diào)控作用;在正常角膜中轉(zhuǎn)化生長因子-β是處于一種低水平表達狀態(tài)以維持正常的角膜形態(tài)和角膜局部免疫功能;但是在實驗研究過程發(fā)現(xiàn)在角膜化學(xué)傷后產(chǎn)生的角膜新生血管的角膜組織中存在高表達，同時與新生血管的量成一定關(guān)系:隨著新生血管的數(shù)量增多，其表達含量也同時升高;即可認為在角膜新生血管的形成過程中存在一定促進作用。
　　 5、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)
　　 基質(zhì)

7、金屬蛋白酶是一組Zn2+依賴的降解細胞外基質(zhì)成分的內(nèi)源性蛋白水解酶，主要由成纖維細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等合成與分泌。其生物學(xué)功能主要有降解細胞外基質(zhì)膜有效成分、調(diào)節(jié)粘附、直接或間接參與胚胎發(fā)育等。正常組織中其處于抑制狀態(tài)。有研究表明當角膜產(chǎn)生新生血管時，其處于強表達，并在新生血管膜的周邊血管外的基質(zhì)中顯著增多。
　　 近年來根據(jù)對角膜新生血管生長機制研究、動物實驗、細胞培養(yǎng)和臨床實驗研究，并針對發(fā)病機制和原理，出現(xiàn)多種治療方法

8、及治療藥物;各種藥物及治療方法都能在一定程度上對角膜新生血管起治療作用，不僅可以抑制角膜新生血管的增殖，同時可引起已形成的新生血管出現(xiàn)萎縮、凋亡等。這為治療角膜新生血管提供強有力的動力。1抗VEFG藥物包括VEFG單克隆抗體、VEGFR酪氨酸激酶抑制劑、抗VEGF抗體等;其中使用較廣的有貝伐單抗Bevacizumab，其對 VEGF A的所有亞型都具有親和力，其抗新生血管的主要機制是通過阻止VEGF與內(nèi)皮細胞表面的VEGFR1和VEGF

9、R2受體結(jié)合，阻止血管滲漏和新生血管的形成，從而使內(nèi)源化VEGF的生物活性失效。VEGFR的酪氨酸激酶域是VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的起點，受體介導(dǎo)而被激活，阻斷該位點可以有效的抑制 VEGF介導(dǎo)的血管生成作用。2 CNV抑制因子眾多研究顯示，促血管生長因子的增加打破了控制角膜血管形成的網(wǎng)絡(luò)平衡，使新生血管得以形成，而增加血管生長抑制因子，可加強抗血管形成的力量，使血管控制網(wǎng)絡(luò)重新恢復(fù)平衡，新生血管消退。其中以血管內(nèi)皮抑素最為重要;內(nèi)皮抑素是由O

10、'Relly發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性血管內(nèi)皮細胞增殖的強效抑制劑;內(nèi)皮抑素特異性地作用于內(nèi)皮細胞，尤其是微血管的內(nèi)皮細胞，抑制其遷移，誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制血管的生成。3糖皮質(zhì)激素糖皮質(zhì)激素具有顯著的抗炎和免疫抑制作用，可以減少炎性滲出，抑制成纖維細胞增生和新生血管的生成。有研究發(fā)現(xiàn)其對新生血管的抑制作用主要通過抑制內(nèi)皮細胞的移行及血管形成。4血管抑素(Angiostatin AS)K1-4血管抑素K1-4是纖溶酶原的降解片段并具有強大的抑制新生

11、血管形成作用，可特異地抑制處于增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細胞并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的凋亡，來發(fā)揮強大的抑制新生血管的作用，并且不影響靜止的內(nèi)皮細胞。雖然對于角膜新生血管的治療方法多樣，但仍然未有一種療效較為確切、實用的治療方法。
　　 本課題主要目的是通過配制不同濃度的血管抑素眼用溶液，以研究血管抑素對堿燒傷后角膜新生血管的抑制作用及最佳濃度。
　　 目的:
　　 1、探討不同濃度的血管抑素對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的抑制作用

12、;
　　 2、探討血管抑素眼用溶液在大鼠角膜堿燒傷后的角膜新生血管中影響CD31的表達情況及比較各組角膜新生血管的生長情況。
　　 方法:
　　 1、在體外培養(yǎng)的情況下，將傳代培養(yǎng)后的人臍靜脈內(nèi)皮細胞分為三組:對照培養(yǎng)組（空白組）、A組（16ml/L血管抑素培養(yǎng)組）、B組（32ml/L血管抑素培養(yǎng)組），通過MTT法觀察用藥后24h、48h、72h三組細胞的抑制率;將培養(yǎng)72h后的細胞粉碎，分別采用VEGF和GAP

13、DH引物，以cDNA為模板按照下面的反應(yīng)體系進行PCR特異性擴增，通過熒光定量PCR法測定各組VEGF蛋白的RNA表達情況;收集A組、B組、C組三組細胞以western blot法檢測VEGF蛋白表達量。
　　 2、通過堿燒傷制備動物角膜新生血管模型; SPF級SD大鼠24只，隨機分成4組，每組6只。分別給予生理鹽水、A組（25ug/mL AS滴眼劑）、B組（50ug/mLAS滴眼劑）、C組（75ug/mLAS滴眼劑），4次/d

14、至實驗結(jié)束。術(shù)后常規(guī)滴用氧氟沙星滴眼液4次/d，1滴/次，用藥3d，預(yù)防感染。通過計算角膜新生血管的生長情況、HE染色、RT-PCR、Western bolt檢測堿燒傷后不同濃度的角膜組織中CD31的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、血管抑素對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的抑制實驗表明:隨著血管抑素作用時間的延長和濃度的遞增對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的抑制作用也逐漸增強，且與對照組相比差異均有顯著性意義(P＜0.01);

15、　　 2、大鼠角膜堿燒傷后各時間點A、B、C組CNV面積較鹽水組少(P＜0.05)，C組堿燒傷14天各時間新生血管面積較其他三組明顯減少(P＜0.05);血管抑素治療兩周后，對照組大鼠角膜全層可見大量新生血管形成及慢性炎細胞浸潤;各治療組角膜新生血管均不同程度較對照組減少;
　　 3、各實驗組角膜組織中CD31-mRNA及CD31表達均少于對照組(P＜0.05)，同時在實驗組中與血管抑素的濃度呈負相關(guān)性。
　　 結(jié)論:

16、
　　 1、通過體外細胞培養(yǎng)技術(shù)，證明血管抑素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的抑制作用與血管抑素濃度和作用時間成雙重負相關(guān)性。
　　 2、血管抑素作用VEGF靶點后抑制血管新生，從而抑制內(nèi)皮細胞的遷移、生成、重組，減少內(nèi)皮細胞的生長;本實驗中通過檢測各組角膜組織中CD31這一血小板內(nèi)皮細胞粘附分子的表達量，證明新生血管的生長在血管抑素制劑治療下的情況。試驗中可以明顯觀察到各組角膜新生血管的生長情況，可得知對新生血管的抑制效果與血管抑