分泌IL-10B細胞在小鼠病毒性心肌炎發(fā)病中的作用及其機制.pdf

1、病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由病毒感染所致的一種心肌炎癥性疾病。大部分的VMC可以完全康復(fù)，但少部分進展為擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)。目前VMC的發(fā)病機制尚未完全闡明。研究表明T細胞在VMC的發(fā)病環(huán)節(jié)中扮演重要角色，其中Th1細胞在VMC急性期即出現(xiàn)顯著增高并分泌IFN-γ參與心肌炎癥反應(yīng)，Th17細胞通過分泌IL-17加重心肌損傷和促進纖維化。
　　調(diào)節(jié)性

2、B細胞(regulatory B cells，Bregs)是一類新發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)性功能的B細胞。其中最重要的亞型是分泌IL-10B細胞(IL-10-producing B cells)。分泌IL-10B細胞通過IL-10，在細胞水平調(diào)節(jié)其他細胞，尤其是效應(yīng)性T細胞。已有的研究表明，調(diào)節(jié)性B細胞在一些免疫炎癥性疾病中具有調(diào)節(jié)作用。然而，在VMC中，是否存在分泌IL-10B細胞，作用機制如何，目前尚未見報道。為此，本研究用柯薩奇病毒B3(C

3、oxsackievirus B3，CVB3)建立小鼠VMC模型，深入探索分泌IL-10B細胞在小鼠VMC發(fā)病中的作用及其機制，為VMC的治療尋求新靶點。本研究主要通過以下三部分進行。
　　第一部分分泌IL-10B細胞在小鼠VMC發(fā)病過程中的變化
　　目的:探討分泌IL-10B細胞在VMC發(fā)病過程中的動態(tài)變化，及其與Th1、Th17細胞和心肌病理等指標(biāo)的關(guān)系。
　　方法:4周齡BALB/c小鼠80只，隨機分為VMC組(n

4、=50)和對照組(n=30)，兩組BALB/c小鼠均設(shè)1、2、4周3個時點亞組。CVB3腹腔注射建立小鼠 VMC模型，每個時點亞組小鼠分別為12只、18只、20只。腹腔注射PBS建立對照組，每個時點亞組小鼠均為10只。在相應(yīng)時間點從兩組各取10只小鼠，用流式細胞術(shù)檢測脾臟分泌IL-10B細胞、CD1dhiCD5+B細胞、Th1細胞及Th17細胞，并且對心肌組織進行HE染色觀察病理變化、計算心肌病理積分。
　　結(jié)果:
　　1、

5、VMC組心肌組織HE染色顯示，CVB3感染后1周出現(xiàn)心肌細胞局灶壞死和炎癥細胞的浸潤;第2周亞組心肌細胞壞死病灶增加、炎癥細胞浸潤明顯增多;第4周亞組未見心肌細胞壞死、炎癥細胞浸潤不明顯。對照組各亞組心肌組織病理均正常。
　　2、VMC組心肌病理積分在1、2、4周亞組分別為2.30±0.48、2.90±0.74及1.40±0.52，與對照組各亞組（均為0）相比均顯著增高（P均＜0.01），并且VMC組第2周亞組明顯高于第1周亞組(

6、P＜0.05)及第4周亞組(P＜0.01)。
　　3、VMC組各亞組脾臟分泌IL-10B細胞與對照組各亞組比較，1、2、4周亞組比例均明顯升高(2.70％±0.69％ versus0.90％±0.36％;3.10％±0.50％ versus1.18％±0.31％;1.37％±0.35％ versus0.97％±0.21％。P均＜0.01)，并且VMC組第1、2周亞組均明顯高于第4周亞組（P均＜0.01）。
　　4、VMC組各

7、亞組脾臟Th1細胞與對照組各亞組比較，1、2、4周亞組均顯著增高(6.62％±1.00％ versus3.44％±1.34％;8.28％±2.04％ versus3.52％±1.15％;5.61％±1.14％ versus3.97％±1.01％。P均＜0.01），并且VMC組第2周亞組明顯高于第1周亞組(P＜0.05)及第4周亞組(P＜0.01)。
　　5、VMC組各亞組脾臟Th17細胞與對照組各亞組相比，在1、2、4周亞組均顯著

8、增高(2.46％±0.50％ versus0.98％±0.40％，P＜0.05;5.35％±1.11％ versus1.12％±0.51％，P＜0.01;2.49％±0.48％ versus0.98％±0.27％，P＜0.01)，并且VMC組第2周亞組明顯高于第1及第4周亞組（P均＜0.01）。
　　6、與對照組各亞組比較，VMC組1、2、4周亞組脾臟CD1dhiCD5+B細胞均明顯增高(5.32％±1.20％ versus2.1

9、0％±0.66％;5.56％±1.03％versus2.70％±0.63％;4.85％±1.02％ versus2.85％±0.69％。P均＜0.01），VMC組各亞組間無明顯差別（P均＞0.05）。
　　結(jié)論:CVB3腹腔注射成功建立小鼠VMC模型;VMC小鼠的脾臟分泌IL-10B細胞在發(fā)病的1、2、4周均明顯增多，并且呈先高后低的變化趨勢，而CD1dhiCD5+B細胞在發(fā)病過程中持續(xù)增多;VMC小鼠Th1細胞和Th17細胞在發(fā)

10、病的1、2、4周均明顯增多，并且第2周達高峰;伴隨VMC模型的心肌炎發(fā)生、發(fā)展及恢復(fù)的病理改變，小鼠的分泌IL-10B細胞、Th1細胞和Th17細胞比例有相應(yīng)平行動態(tài)改變趨勢。
　　第二部分分泌IL-10B細胞對VMC小鼠Th1和Th17細胞的調(diào)節(jié)作用
　　研究一、目的:探討過繼分泌IL-10B細胞對缺乏T和B細胞小鼠VMC的影響。方法:4周齡雄性BALB/c背景的SCID小鼠40只隨機分成干預(yù)組(n=20)和對照組(n=2

11、0)。CVB3感染SCID小鼠建立VMC模型。干預(yù)組CVB3感染SCID小鼠前1天，尾靜脈注射來源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B細胞。對照組注射生理鹽水作為陰性對照。觀察兩組小鼠的生存情況，并在第14天從每組中隨機選取8只小鼠，對心肌組織進行HE染色觀察病理變化、計算心肌病理積分。
　　結(jié)果:
　　1、干預(yù)組心肌病理積分與對照組比較無明顯差別(3.28±0.28 versus3.47±0.24，P＞0.05)。
　

12、　2、兩組的中位生存時間無差異(8.70d±0.57d versus7.93d±0.65d，P＞0.05)。
　　結(jié)論:過繼分泌IL-10B細胞不能減輕缺T和B細胞的急性VMC小鼠的心肌組織的病理改變，也不能延長VMC小鼠的生存時間，提示分泌IL-10B細胞在小鼠VMC發(fā)病中通過T細胞而起作用。
　　研究二、目的:探討過繼分泌IL-10B細胞對缺B細胞小鼠VMC的影響。
　　方法:SCID小鼠60只隨機分成3組:naǐ

13、ve組(n=20)、sensitized組(n=20)和contro1組(n=20)。尾靜脈注射CD4+T細胞同時腹腔注射CVB3建立一個缺乏B細胞的小鼠VMC模型。在VMC模型建立前1天，分別尾靜脈注射來源正常BALB/c小鼠（na(ǐ)ve組）、急性VMC BALB/c小鼠(sensitized組)的分泌IL-10B細胞，control組注射生理鹽水作為陰性對照。觀察3組小鼠14天的生存情況，并在第14天從各組中隨機選取10只小鼠，

14、HE染色觀察病理變化、計算心肌病理積分，RT-PCR檢測Th1轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγ t的mRNA表達量，流式細胞術(shù)檢測脾臟Th1和Th17細胞的比例。
　　結(jié)果:
　　1、與對照組比較，naǐve組的心肌病理積分無變化(2.12±1.07 versus2.87±0.85，P＞0.05)，而sensitized組心肌病理積分顯著減低(1.21±0.60 versus2.87±0.85，P＜0.01)。<

15、br>　　2、與對照組比較，naǐve組的中位生存時間無顯著差異(12.50d±0.70d versus11.05d±0.68d，P＞0.05)，而sensitized組中位生存時間明顯延長(13.4d±0.24d versus11.05d±0.68d，P＜0.05)。
　　3、與對照組比較，na(ǐ)ve組的VMC小鼠中脾臟Th1和Th17細胞的比例無變化(4.10％±1.74％ versus5.83％±2.02％;2.24％±

16、1.34％ versus2.92％±1.32％。P均＞0.05)，而sensitized組VMC小鼠脾臟Th1和Th17細胞的比例均顯著降低(3.20％±2.31％ versus5.83％±2.02％,P＜0.01;1.35％±1.24％ versus2.92％±1.32％，P＜0.05)。
　　4、與對照組比較，naǐve組心肌T-bet mRNA和RORγt的mRNA表達量均無明顯變化(3.76±1.49 versus4.62

17、±2.60;1.55±0.90 versus2.67±1.92。 P均＞0.05)，而sensitized組心肌T-bet和RORγ t的mRNA表達量均明顯降低(1.31±1.28 versus4.62±2.60，P＜0.01;1.30±0.35 versus2.67±1.92，P＜0.05)。
　　結(jié)論:免疫性過繼來源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B細胞可減輕缺B細胞小鼠的心肌炎病理改變、延長生存時間，其機制主要通過下調(diào)T-

18、bet和RORγ t的mRNA轉(zhuǎn)錄而降低Th1細胞和Th17細胞比例;過繼來源于正常小鼠的分泌IL-10B細胞不能調(diào)節(jié)缺B細胞VMC小鼠的T-bet和RORγ t的mRNA轉(zhuǎn)錄以及Th1細胞和Th17細胞的比例，因而缺B細胞VMC小鼠的心肌炎病理表現(xiàn)及生存時間也沒有受到影響。提示分泌IL-10B細胞通過下調(diào)T-bet和RORγ t的mRNA轉(zhuǎn)錄而降低Th1細胞和Th17細胞比例，從而抑制VMC小鼠心肌的炎癥損傷。
　　第三部分過繼

19、分泌IL-10B細胞對小鼠VMC發(fā)病過程的影響
　　目的:探討不同時點過繼分泌IL-10B細胞對VMC小鼠心肌損傷及預(yù)后的影響。
　　方法:4周齡BALB/c小鼠40只隨機分成干預(yù)組(n=20)和對照組(n=20)。CVB3感染BALB/c小鼠建立VMC模型。干預(yù)組分別于CVB3感染前1天，VMC第3天或第7天尾靜脈注射來源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B細胞。對照組尾靜脈注射生理鹽水。觀察兩組小鼠14天的生存情況并在第1

20、4天從每組中隨機選取10只小鼠，HE染色觀察病理變化、計算心肌病理積分，流式細胞術(shù)檢測脾臟Th1和Th17細胞的比例。
　　結(jié)果:
　　1、與對照組比較，VMC模型建立前過繼分泌IL-10B細胞的干預(yù)組VMC小鼠的中位生存時間明顯延長(13.80d±0.11d versus11.80d±0.62d，P＜0.05)，心肌病理積分明顯低于對照組(2.08±0.54 versus2.98±0.55，P＜0.01)，脾臟Th1和Th

21、17細胞的比例均顯著降低(4.57％±2.04％versus8.71％±2.29％;3.58％±0.57％ versus5.36％±1.08％。P均＜0.01)。
　　2、與對照組比較，VMC第3天過繼分泌IL-10B細胞的干預(yù)組不能延長VMC小鼠中位生存時間(12.95d±0.37d versus11.75d±0.64d，P＞0.05)，但心肌病理積分明顯減低(2.08±0.54 versus2.94±0.30，P＜0.01)，

22、脾臟Th1和Th17細胞的比例均顯著降低(5.23％±1.94％ versus8.17％±2.21％;3.35％±0.62％ versus5.14％±1.20％，P均＜0.01)。
　　3、與對照組比較，VMC第7天過繼分泌IL-10B細胞的干預(yù)組VMC小鼠的中位生存時間無顯著差異(12.55d±0.49d versus12.20d±0.57d，P＞0.05)，心肌病理積分無變化(2.47±0.66 versus3.01±0.56

23、，P＞0.05)，脾臟Th1和Th17細胞的比例亦無顯著差異(4.60％±1.97％ versus6.27％±2.02％;4.03％±0.60％versus4.87％±1.18％。P均＞0.05)。
　　結(jié)論:在CVB3建立小鼠VMC前過繼分泌IL-10B細胞可下調(diào)Th1和Th17細胞比例，從而減輕心肌炎癥損傷、延長VMC小鼠的生存時間;VMC小鼠在發(fā)病的第3天過繼分泌IL-10B細胞可下調(diào)Th1和Th17細胞比例從而減輕心肌炎癥

24、損傷，但不能延長生存時間;VMC小鼠在發(fā)病第7天過繼分泌IL-10B細胞不能下調(diào)Th1和Th17細胞比例，也不能改變心肌炎癥損傷及VMC小鼠生存時間。
　　本研究結(jié)果提示:
　　1、VMC小鼠的分泌IL-10B細胞在發(fā)病的1、2、4周均明顯增多，并且呈先高后低的變化趨勢;伴隨VMC模型的心肌炎發(fā)生、發(fā)展及恢復(fù)的病理改變，小鼠的分泌IL-10B細胞、Th1細胞和Th17細胞比例有相應(yīng)平行動態(tài)改變趨勢。
　　2、分泌IL-