靶向JAK3激酶對博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的防治作用及機制研究.pdf

1、目的：間質(zhì)性肺疾病(Interstitial lung diseases， ILD)是結(jié)締組織病(Connective tissue disease，CTD)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)最常見及最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，近年來發(fā)病率及死亡率呈明顯上升的趨勢。激素與免疫抑制劑對這些病人的療效欠佳。我們實驗室先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子受體信號通路的細(xì)胞漿酪氨酸激酶(Janus kinase3，JAK

2、3)，是一個引起病理性固有免疫應(yīng)答與炎癥因子風(fēng)暴的決定子,選擇性JAK3抑制劑能減輕H5N1病毒抗原HA導(dǎo)致的肺免疫病理損傷。我們因而推測選擇性JAK3抑制劑通過調(diào)節(jié)異常免疫炎癥，可能在治療自身免疫相關(guān)的肺纖維化疾病中發(fā)揮重要作用。在本研究中，我們采納JAK3基因敲除鼠與新型的JAK3抑制劑CP-690550，對靶向JAK3在防治博萊霉素(Bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化中的作用及其機制進(jìn)行了研究。
　　方法：⑴將6

3、-8周JAK3敲除的B6129S4-JAK3tmlLjb小鼠（JAK3-/-）及野生型(JAK3+/+) B6129SF2/J小鼠隨機分為五組：JAK3+/++Saline、JAK3+/++博萊霉素、JAK3+/++博萊霉素+CP-690550、JAK3-/-+Saline、JAK3-/-+博萊霉素。博來霉素(3mg/kg)經(jīng)小鼠氣道內(nèi)霧化制備肺纖維化模型。給予博萊霉素前一天，在野生型小鼠皮下植入膠囊滲透壓泵(ALZET? Osmoti

4、c Pumps，＃2002)持續(xù)給予CP-690550（15mg/kg/d）或皮下植入假手術(shù)。給予博萊霉素第7、13、20天，處死小鼠并進(jìn)行肺泡灌洗。檢測肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞分類計數(shù)及總蛋白含量，并流式分析免疫細(xì)胞亞型。免疫組化及masson染色檢測肺組織中CD3、α-SMA及膠原的表達(dá)。堿水解法檢測肺組織中羥脯氨酸的含量。與此同時，在給予博萊霉素后的28天期間，觀察各組小鼠的生存率與體重變化。⑵博來霉素給藥后第7天、13天、20

5、天，處死小鼠，行肺泡灌洗術(shù)及眼球取血采集血清及肺泡灌洗液，分離小鼠肺臟進(jìn)行Western blot分析。液相芯片檢測肺泡灌洗液及血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平；Western blot方法檢測肺組織p-STAT3、p-ERK、p-Smad2、p-Smad3的表達(dá)。離體培養(yǎng)人肺泡上皮細(xì)胞（A549）及人正常的成纖維細(xì)胞(NLFB)，液相芯片分析CP-690550干預(yù)對細(xì)胞因子混合物Cytomix（TGF-β1、IL-1β、IFN-γ）刺激A54

6、9細(xì)胞后培養(yǎng)上清IL-6水平的影響，Western blot觀察其干預(yù)在單獨TGF-β1(5ng/ml)或同時給予IL-6(100ng/ml)刺激下，對NLFB表達(dá)間充質(zhì)蛋白纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)的影響。
　　結(jié)果：①肺病理切片及肺泡灌洗液結(jié)果顯示給予CP-690550治療或JAK3基因缺失明顯減輕了博萊霉素致小鼠肺部的炎癥病理改變，伴隨顯著減少了肺泡灌洗液中蛋白含量及細(xì)胞總數(shù)。②氣道給予博萊霉素后，7、13和2

7、0天的肺泡灌洗液中細(xì)胞分類顯示，野生型小鼠肺部淋巴細(xì)胞持續(xù)維持在高水平，而給予CP-690550治療或JAK3基因缺失小鼠的淋巴細(xì)胞的比例明顯減少。免疫組化檢測肺組織CD3的表達(dá)結(jié)果顯示，給予CP-690550治療或JAK3基因缺失明顯抑制肺部T淋巴細(xì)胞的募集。應(yīng)用CD3、CD8、CD4、CD25、Foxp3的特異性抗體標(biāo)記肺泡灌洗液中的細(xì)胞并進(jìn)行流式分析。與野生型小鼠相比，給予CP-690550治療及JAK3基因缺失小鼠氣道給予BLM

8、后肺泡灌洗液中CD3+CD8+T的百分比較少；給予CP-690550治療及JAK3基因缺失小鼠的肺泡灌洗液中沒有檢測到Treg。③肺病理切片顯示：氣道給予BLM的野生型小鼠肺部有大量的膠原沉積和伴隨大量淋巴細(xì)胞浸潤的肺間質(zhì)區(qū)域有強陽性的α-SMA染色的典型纖維化病理改變，但這些改變并未在給予CP-690550治療及JAK3基因缺失小鼠肺中發(fā)現(xiàn)。與野生型小鼠相比，經(jīng)CP-690550治療及JAK3基因缺失小鼠肺組織中羥脯氨酸的含量明顯減少

9、。④氣道給予博萊霉素后第20天，給予CP-690550治療小鼠及JAK3基因缺失小鼠生存率分別為：100％、84.6%，而野生型小鼠生存率僅有38.5%。體重變化曲線顯示，野生型小鼠的體重明顯持續(xù)下降，而給予CP-690550治療及JAK3基因缺失小鼠的體重并無明顯改變。⑤在氣道給予博萊霉素的第7、13、21天，液相芯片檢測肺泡灌洗液和血清中炎癥及促纖維化的細(xì)胞因子動力學(xué)改變。我們發(fā)現(xiàn)給予博萊霉素早期(第7天)無論給予CP-690550

10、治療或否，肺泡灌洗液中IL-6及TGF-β1的表達(dá)水平均較正常對照上調(diào)，同時在給予CP-690550治療的小鼠肺泡灌洗液中， IL-6及TGF-β1的表達(dá)水平高于未給予CP-690550治療的野生型小鼠。我們觀察發(fā)現(xiàn)：經(jīng)CP-690550治療的小鼠肺泡灌洗液中早期高表達(dá)的IL-6及 TGF-β1迅速恢復(fù)到正常水平。而未經(jīng)CP-690550治療的野生型小鼠的肺泡灌洗中IL-6及TGF-β1持續(xù)升高。JAK3基因缺失小鼠給予博萊霉素早期肺泡

11、灌洗液中TGF-β1明顯低于與野生型小鼠。⑥在博萊霉素?fù)p傷的早期，野生型小鼠血清中TGF-β1的水平比對照組及給予CP-690550治療小鼠低，但其在后期顯著升高。在急性期后，野生型小鼠血清中TGF-β1及IL-6的表達(dá)水平持續(xù)升高，但給予CP-690550治療小鼠的TGF-β1及IL-6的表達(dá)水平迅速下降，且顯著低于未接受CP-690550治療小鼠。JAK3基因缺失小鼠的鹽水對照組與博萊霉素組相比，血清中IL-6及TGF-β1的表達(dá)水

12、平?jīng)]有區(qū)別。⑦在給予博萊霉素?fù)p傷的晚期，野生型小鼠肺泡灌洗液中IP-10的表達(dá)水平明顯下調(diào)，但經(jīng)CP-690550治療小鼠的IP-10水平?jīng)]有顯著變化。JAK3基因缺失小鼠肺泡灌洗液及血清中IP-10的表達(dá)水平均上調(diào)。在博萊霉素?fù)p傷早期，野生型小鼠血清中IFN-γ、IL-17A和IL-13的表達(dá)水平明顯低于對照組，而給予CP-690550治療小鼠的血清中IFN-γ、IL-17A和IL-13水平?jīng)]有明顯變化。⑧免疫印跡的結(jié)果表明，給予CP

13、-690550治療或JAK3基因缺失抑制了博萊霉素誘導(dǎo)的肺組織STAT3的高度磷酸化。博萊霉素誘導(dǎo)野生型小鼠或JAK3基因缺失小鼠肺部ERK1/2的磷酸化，但給予CP-690550治療小鼠未見同樣的改變。各組小鼠均沒有觀察到TGF-β1/Smad通路的活化。⑨液相芯片分析表明CP-690550能明顯減少Cytomix(TGF-β1、IL-1β、IFN-γ)刺激A549細(xì)胞分泌IL-6，并能抑制細(xì)胞因子TGF-β1和IL-6誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞

14、纖連蛋白的過表達(dá)。
　　結(jié)論：⑴靶向JAK3或JAK3基因缺失抑制了免疫炎癥細(xì)胞向肺內(nèi)的募集，下調(diào)了細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫炎癥，同時減少了T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制微環(huán)境，保護(hù)小鼠免受博萊霉素所致的急性肺損傷及纖維化。⑵研究揭示：JAK3發(fā)揮作為一個細(xì)胞因子受體激活核心增強子的作用，能夠通過產(chǎn)生大量細(xì)胞因子增強固有免疫炎癥反應(yīng)，使免疫損傷誘導(dǎo)的促纖維化因子TGF-β1及IL-6持續(xù)性增加，因而高度活化了IL-6/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，